Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells through genetic reprogramming influenced greatly development of basic research in regenerative medicine as well as in vitro toxicology and pharmacology field. The progress in the “safemethods” of hiPSC generation (without the integration of the transgene into the host genome, eg., mRNA, recombinant proteins, miRNA’s, episomal vectors) gave an opportunity to use this cells in personalized cell therapy. In addition, the hiPSC serve as ethically non-controversial in vitro model of early human development which is an alternative to the model of human embryonic stem cells (hESC). The cycle of publications chosen for the theses investigates the influence of stimulation of mitochondrial biogenesis on the early stages of hiPSC neural differentiation. In this study, neural differentiation of hiPSC resulted in obtaining three distinct cells populations: neural stem cells (NSC), early neural progenitors (eNP), and neural progenitors (NP) however, the population of eNP cells has been characterized for the first time. Analysis of the gene and protein expression have shown that NSC, eNP and NP cell populations were significantly different in the level of unique markers for early neural development. The obtained cell populations were investigated for their sensitivity to compounds stimulating the mitochondrial biogenesis: Pyrroloquinoline quinone (PQQ) or idebenone (IDB), which were added independently. The results revealed significant changes in the cells viability, free radical level (ROS) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) upon the treatment with PQQ and IDB in all tested populations. The expression of genes related with mitochondrial biogenesis regulation: NRF1, PPARGC1A andTFAM were also significantly different. However exclusively at the eNP stage, after incubation with PQQ and IDB, all markers indicating stimulation of mitochondrial biogenesis were significantly elevated.This included upregulation of NRF1, PPARGC1A, TFAM gene expression, increased number of copies of mitochondrial DNA (mtDNA) and significant elevation of expression of proteinsimportant for mitochondrial function: COX-1 and SDHA. Gene expression analysis of neural differentiation upon PQQ treatment revealed in NSC and eNP stages of developmentsimultaneous increase in expression of PPARGC1A (main regulator of mitochondrial biogenesis) and astrocyte marker GFAPaccompanied with repression of the neuronal marker MAP2. IDB in all stages of development yielded a similar effect with the exception of eNP, where stimulation of theexpression of both GFAP and MAP2was observed, although the increase in GFAP expression was higher. The above data demonstrate the existence of developmental “window of sensitivity" for investigated factors (PQQ, IDB) inducing mitochondrial biogenesis at eNP stage of development and the possibility of influencing of the neural differentiation pathways via PQQ and IDB in favour of astrocytic fate.
Biblliografia zawiera 40 pozycji.
95 s.: il., wykr.tabl., fotogr. ; 30 cm.
Odkrycie, że komórki somatyczne można reprogramować do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC, ang. induced Pluripotent Stem Cells) pozwoliło na znaczny rozwójbadań w dziedzinie medyczny regeneracyjnej, jak również badań toksykologicznych oraz farmakologicznych in vitro. Postęp w otrzymywaniu ludzkich iPSC (hiPSC,ang. human iPSC) tzw. „bezpiecznymi metodami” tj. bez integracji transgenu do genomu gospodarza (np. stosując mRNA, białka rekombinowane, miRNA, wektory episomalne) przyczynił się do wykorzystania tych komórek w spersonalizowanej terapii komórkowej. Dodatkowo hiPSC stanowią „niekontrowersyjną etycznie”alternatywę dla ludzkich zarodkowych komórek macierzystych (hESC,ang. human Embryonic Stem Cells) w modelowaniu in vitrowczesnych etapów rozwojuczłowiekadzięki zdolności doróżnicowania we wszystkie tkanki organizmu. W cyklu publikacji stanowiących rozprawędoktorskąprzedstawiono wyniki oceny wpływu stymulacji biogenezy mitochondriów na wczesne etapy różnicowania neuralnego komórek hiPSC. W tym celu z hiPSC otrzymano trzy populacje komórkowe: neuralne komórki macierzyste (NSC, ang. Neural Stem Cells), wczesne progenitory neuralne (eNP, ang. early Neural Progenitors) oraz progenitory neuralne (NP, ang. Neural Progenitors), przy czym komórki eNP scharakteryzowano po raz pierwszy. Badane populacje komórkowe różniłysię istotnie pod względem ekspresjimarkerów typowych dla rozwoju neuralnego na poziomie mRNA i białek. Komórki NSC, eNP oraz NP zostały poddane ekspozycji na substancje indukujące biogenezę mitochondriów: pirolochinolinochinon (PQQ) lub idebenon (IDB). Pod wpływem tych związków wykazano istotne zmiany w parametrach ważnych dlaprocesów życiowychkomórki: żywotności, poziomie wolnych rodników (RFT), potencjale błony mitochondrialnej (ΔΨm) oraz ekspresji genów związanych z regulacją biogenezy mitochondriów: NRF1, PPARGC1A, TFAM. Wzrostowi ekspresji tych genów towarzyszył wzrostpozostałych badanych markerów biogenezy mitochondriów: liczby kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA) oraz ekspresji białek SDHA i COX-1, wyłącznie w stadium eNP. W komórkach NSC i eNP, po inkubacji z PQQ zanotowano równoczesny wzrost ekspresji genu PPARGC1Aoraz markera astrocytów GFAP, przy jednoczesnym spadku ekspresji markera neuronalnego MAP2. IDB działał podobnie we wszystkich stadiach, z wyjątkiem eNP, gdzie stymulował ekspresję zarówno GFAP jak i MAP2. Powyższe wyniki świadczą o istnieniu w stadium eNP „przedziału wrażliwości rozwojowej” na PQQ oraz IDB, a także o pozytywnym wpływie stymulacji biogenezy mitochondriów na różnicowanie komórek hiPSC w kierunku astrocytarnym.
