Mutations in MECP2 gene encoding for methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2), lead to Rett Syndrome (RTT). In patient with RTT, a short life span with normal development is followed by developmental stagnation connected with autonomic dysfunction and neuropathology. Among wide spectrum of MECP2 mutations, the R270X truncated mutation has been reported to be associated with the most sever clinical phenotypes of RTT and with increased mortality. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the effect of R270X mutation on the function of MeCP2 protein. For this purpose of studies we generated MecpR270_EGFP transgenic (TG270) mice and MecpR270_EGFP knockin (KI) mice which are equivalent to the human R270X mutation. Western Blot analysis performed with whole brain of the wild type (WT), TG270 and KI mice, revealed the presence of the endogenous MeCP2 (70 kDa) and truncated MeCP2R270_EGFP (65 kDa) in TG270 mice. However, only MeCP2R270_EGFP protein was expressed in KI mice. In order to evaluate neurological abnormalities in KI mice, the preliminary phenotypic analysis of KI mice at different age was performed. We observed, that KI mice manifested hindlimb clasping phenotype with increasing severity with the age, which indicates a progressive neurological impairment. To determine any defect in the process of neuronal development and differentiation, the hippocampal primary neurons from WT, TG270, KI and knockout (KO) mice were cultured and neuronal parameters such as soma size, dendrites length and primary, secondary, and tertiary branching sites were evaluated. We observed altered neuronal parameters for TG270, KI and KO neurons as compared to WT neuronal cells. Strikingly, the changes in neuronal parameters were more pronounced in KI neurons in comparison to KO, thus suggesting deleterious effect of truncated MeCP2R270_EGFP protein in neurons. To evaluate the differential regulation of MeCP2 target genes involved in synaptogenesis (Ddc, Gabra6, Htr5b, Sst, Tph2, Grin2a, Grin2d), the quantitative real time PCR (qRT-PCR) analysis on total RNA from hippocampus and cerebellum of WT, TG270, KI and KO mice was performed. We demonstrated brain region specific genes regulation in TG270, KI and KO mice with pronounced effect in cerebellum when compared to hippocampus. Furthermore, chromosome 15 was identified and confirmed as the integration site of Mecp2R270_EGFP transgene in TG270 mouse genome by using GenomeWalker DNA walking method, and genotyping PCR was established in order to distinguish TG270 homozygous from heterozygous mice. Hence, the mouse breeding strategy can be facilitated and a higher proportion of KI male mice can be obtained for our studies.
Mutacje genu MECP2, kodującego białko methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2), prowadzą do syndromu Retta (RTT). U pacjentów z RTT, po krótkim okresie normalnego rozwoju, następuje zastój, co związane jest z dysfunkcją układu autonomicznego i patologią układu nerwowego. Spośród mutacji genu MECP2, mutacja R270X jest związana z najcięższym obrazem klinicznym w RTT jak i ze zwiększoną śmiertelnością. Stąd, głównym założeniem tej pracy było zbadanie wpływu mutacji R270X na funkcję białka MeCP2. W tym celu uzyskano myszy transgeniczne Mecp2R270_EGFP (TG270) oraz myszy knockin Mecp2R270_EGFP (KI), które stanowią model dla ludzkiej mutacji R270X. Badania przeprowadzone metodą Western Blot na mózgach myszy dzikich (WT), TG270 oraz KI, wykazały obecność zarówno endogennego MeCP2 (70 kDa) jak i zmutowanego MeCP2R270_EGFP (65 kDa) u myszy TG270. Natomiast w przypadku myszy KI tylko białko MeCP2R270_EGFP ulegało ekspresji. W celu określenia nieprawidłowości neurologicznych u myszy KI, przeprowadzono wstępne badanie fenotypu tych myszy w różnym wieku. Zaobserwowano, iż myszy KI wykazują fenotyp składania kończyn tylnych nasilający się wraz z wiekiem, co wskazuje na progresywne zaburzenia neurologiczne. W celu stwierdzenia upośledzenia procesu rozwoju i różnicowania neuronalnego, założono hodowlę pierwotną komórek nerwowych hipokampa myszy WT, TG270, KI i knockout (KO), oraz określono parametry komórek nerwowych tj. wielkość ciała komórki, długość dendrytów oraz liczbę pierwszo-, drugo- i trzeciorzędnych miejsc rozgałęzień dendrytów. Zaobserwowano różnice w parametrach neuronów TG270, KI i KO w porównaniu do WT, które były szczególnie widoczne w przypadku neuronów KI. Sugeruje to szkodliwy wpływ zmutowanego białka MeCP2R270_EGFP na komórki nerwowe. W celu określenia różnic w ekspresji genów docelowych dla białka MeCP2 i zaangażowanych w synaptogenezę (Ddc, Gabra6, Htr5b, Sst, Tph2, Grin2a, Grin2d), przeprowadzono reakcje łańcuchowe polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. qRT-PCR), wykorzystując całkowity RNA hipokampa i móżdżku myszy WT, TG270, KI i KO. Przedstawiono ekspresję genów u myszy TG270, KI oraz KO, która jest specyficzna dla danego rejonu mózgu, i która jest zróżnicowana w większym stopniu w móżdżku niż w hipokampie. Ponadto, wykorzystując metodę GenomeWalker, ustalono i potwierdzono, iż chromosom 15 jest miejscem integracji transgenu Mecp2R270_EGFP w genomie myszy TG270, jak również opracowano genotypowanie techniką PCR w celu rozróżnienia myszy TG270 hetero- i homozygotycznych, dzięki czemu wydajność hodowli, a w konsekwencji liczba samców KI potrzebnych do badań, mogą być zwiększone.
