Designation of the minimum inhibitory concentration in the derivatives of amines of the expected antibacterial inhibitory action of the Helicobacter pylori growth

Rozpowszechnienie zakażenia Helicobacter pylori (H. pylori) dotyczy połowy populacji ludzkiej. Bakteria ta odgrywa znacząca rolę w etiopatogenezie schorzeń przewodu pokarmowego. Na przestrzeni ostatnich lat obserwuje się narastającą oporność tego drobnoustroju na antybiotyki i chemioterapeutyki wchodzące w skład schematu eradykacyjnego zalecanego przez European Helicobacter Study Group (EHSG) oraz Polskie Towarzystwo Gastroenterologiczne (PTG). Stanowi to główną przyczynę niepowodzenia terapii oraz skłania do poszukiwania nowych substancji zwiększających skuteczność leczenia i zmniejszających ryzyko wystąpienia działań niepożądanych.Zbadano aktywność przeciwbakteryjną 30 pochodnych amin wobec dwóch szczepów H. pylori (Helicobacter pylori ATCC 43504 – szczep oporny na metronidazol i Helicobacter pylori 132/194 – szczep oporny na klarytromycynę) oraz szczepów kontrolnych Staphylococcus aureus ATCC 25923 i Escherichia coli ATCC 25922. Badane związki zostały zsyntetyzowane w Zakładzie Chemii Bioorganicznej Katedry Chemii Organicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie pod kierunkiem prof. H. Marony. Były one analogami strukturalnymi najsilniej działających wobec H.pylori związków, przebadanych w 2012 roku, w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej UJCM w Krakowie.W pierwszym etapie badań wykonano test skriningowy, czyli ocenę jakościową wrażliwości wymienionych szczepów bakteryjnych na badane związki analogi w stężeniu 10mg/ml. W badaniu zastosowano metodę dyfuzyjno- krążkową.Uzyskane wyniki potwierdziły aktywność wszystkich pochodnych amin wobec użytych w badaniu szczepów H. pylori, przy braku lub niskiej aktywności wobec szczepów E. coli i S. aureus. Nie wykazano zależności między działaniem przeciwbakteryjnym związku a rodzajem oporności badanych szczepów H. pylori.W dokonanej analizie porównawczej aktywności związków analogów ze związkami przebadanymi w 2012 roku wykazano, że silne działanie przeciwbakteryjne związków wywołane było obecnością atomu chloru i/ lub pirydylopiperazyny, jak również lokalizacją grupy hydroksylowej w łączniku między układem ksantonu a podstawnikiem aminoalifatycznym bądź pierścieniem heterocyklicznym. Wykazano ponadto, że za wyższą aktywność związków analogów odpowiadało położenie podstawnika w pozycji para struktury związku, zaś za jej obniżenie obecność grupy metylowej. W drugim etapie badań wykonano test ilościowy dla wybranych 6 związków analogów wykazujących najsilniejsze działanie przeciwbakteryjne w badaniu skriningowym, w którym użyto związków w stężeniu 10 mg/ml, charakteryzujących się wyższą aktywnością przeciwbakteryjną w stosunku do związków dla nich wyjściowych, przebadanych w 2012 roku. Badanie ilościowe mające na celu oznaczenie wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration) przeprowadzono metodą dyfuzyjno-krążkowa, używając kolejnych rozcieńczeń roztworów wybranych związków tj. 5mg/ml, 1mg/ml, 500µg/ml, 200µg/ml, 150µg/ml, 100µg/ml, 75µg/ml, 50µg/ml, 10µg/ml. Uzyskane w badaniu wartości MIC dla najsilniej działającego związku wobec szczepów Helicobacter pylori ATCC 43504 oraz. Helicobacter pylori 132/194 wynosiły odpowiednio 10µg/ml i 100µg/ml.Wyniki badania ilościowego przedstawione w niniejszej pracy mogą mieć istotne znaczenie w określeniu właściwego kierunku w konstruowaniu syntetycznych związków o optymalnej aktywności wobec H. pylori. Budzą także nadzieję, na możliwość stosowania w przyszłości syntetycznych pochodnych amin w eradykacji zakażenia H. pylori w stężeniach zapewniających bezpieczeństwo terapii.

The dissemination of the Helicobacter pylori (H. pylori) infection concerns half of the human population. This bacterium plays an important role in etiopathogenesis of alimentary tract illnesses. Recently growing resistance of this microorganism has been observed to antibiotics and chemotherapeutics component of the eradication diagram recommended by the European Helicobacter Study Group (EHSG) and the Polish Society of Gastroenterology (PTG). This is the major cause of therapy failure and the reason for searching for new substances increasing the effectiveness of the treatment and reducing the risk of occurrence of adverse effects.The antibacterial activity of 30 derivatives of amines to two strains of H. pylori was examined (Helicobacter pylori ATCC 43504 - the strain resistant to metronidazole and Helicobacter pylori 132/194 - strain resistant to clarithromycin) and control strains Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 25922. The examined compounds were synthesized in the Institute of Bioorganic Chemistry Department of Organic Chemistry of Jagiellonian University Collegium Medicum (JUCM) in Cracow under the supervision of Prof. H. Marona. They were structural analogues of the compounds acting most strongly against H.pylori examined in 2012 , in the Institute of the Pharmaceutical Microbiology JUCM in Cracow.In the first stage of the research screening tests were performed, that is quality assessment of the sensibility of the above - mentioned bacterial strains to examined analogue compounds in the concentration of 10mg/ml. In the test the disc diffusion method was used.The obtained results confirmed the activity of all the derivatives of amines towards the H. pylori strains used in the test, without or with low activity towards E. coli and S. aureus strains. No relationship was observed between the antibacterial activity of the compound and the kind of resistance of the examined H. pylori strains. The comparative analysis of the activity of the analogue compounds with the compounds examined in 2012 showed that strong antibacterial activity of the compounds was caused by the presence of a chlorine atom and/or pirydylopiperazine, as well as the location of the hydroxyl in the connection between xanthone and the aminoaliphatic substituent or the heterocyclic ring. Furthermore, it was observed that, the position substituent in the pair position of the structure of compound was responsible for the higher activity of the analogue compounds, while for its reduction the presence of the methyl group. In the second stage of the research a quantitative test was performed for 6 chosen analogue compounds showing the strongest antibacterial activity in the screening test in which there were used compounds in the concentration of 10 mg/ml, characterized by a higher antibacterial activity in relation to the initial for them compounds, examined in 2012. The quantitative study aimed at determining the MIC (Minimal Inhibitory Concentration) value was carried out with the diffusion disc method, using the following dilutions of the solutions of the compounds, i.e. 5mg/ml, 1mg/ml, 500µg/ml, 200µg/ml, 150µg/ml, 100µg/ml, 75µg/ml, 50µg/ ml, 10µg/ml. The obtained MIC values for the most strongly acting compound towards Helicobacter pylori ATCC 43504 and Helicobacter pylori 132/194 strains amounted adequately to 10µg/ml and 100µg/ml.The results of the quantitative study presented in this thesis can be relevant for the definition of the proper direction in the construction of synthetic compounds of the optimum-activity towards H. pylori. They also give hope, to use synthetic derivatives of amines in eradication of H. pylori infections in concentrations ensuring therapy safety in the future.