Minimal concentration of aminoalkanoles that inhibits the growth of Helicobacter pylori in vitro

Zakażenie o etiologii Helicobacter pylori (H. pylori) stwierdza się u około 50% populacji ludzkiej. Jest ono potwierdzonym czynnikiem ryzyka rozwoju choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, raka żołądka, a także chłoniaka żołądka pochodzącego z limfoidalnej tkanki śluzowej typu MALT (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue).Badania prowadzone w wielu ośrodkach naukowych na świecie wskazują, iż zalecana przez European Helicobacter Study Group (EHSG) terapia empiryczna zakażenia H. pylori nie jest skuteczna u wszystkich zakażonych. Główną przyczyną tych niepowodzeń jest zjawisko ciągle narastającej, szczególnie w ostatnich latach, oporności szczepów H. pylori na stosowane leki przeciwdrobnoustrojowe (antybiotyki i chemioterapeutyki). Do selekcji szczepów opornych prowadzi głównie nieprzestrzeganie zasad racjonalnej antybiotykoterapii.Szczególnie niepokojący jest wzrastający globalnie odsetek szczepów H. pylori opornych na metronidazol i klarytromycynę. Aby umożliwić skuteczną terapię tego zakażenia konieczne jest więc opracowanie nowych skuteczniejszych schematów leczenia, a także poszukiwanie leków, które mogłyby się stać alternatywą dla obecnie stosowanych.Zbadano aktywność 23 wybranych pochodnych aminoalkanoli bazujących na układzie ksantonu i kwasu cynamonowego wobec 2 wybranych szczepów H. pylori o różnej oporności, w tym na metronidazol i klarytromycynę. Wykorzystane w pracy związki zsyntetyzowano pod kierunkiem prof. Henryka Marony w Zakładzie Chemii Bioorganicznej Katedry Chemii Organicznej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. W badaniach ilościowej oceny wrażliwości szczepów H. pylori posłużono się metodą dyfuzyjno-krążkową oceniając aktywność badanego związku na podstawie zmierzonej średnicy strefy zahamowania wzrostu bakterii. Badania ilościowe, w których roztwory badanych związków użyte były w stężeniach: 10 mg/ml; 5 mg/ml; 1 mg/ml; 500 µg/ml; 200 µg/ml; 150 µg/ml; 100 µg/ml; 75 µg/ml; 50 µg/ml; 10 µg/ml pozwoliły na określenie wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration) dla każdego z nich. Oznaczona wartość MIC dla większości badanych związków wynosiła od 500 µg/ml do 10 µg/ml.W celu ilościowej analizy aktywności przeciwbakteryjnej badanych związków obliczono średnią wartość MIC dla szczepu kontrolnego Helicobacter pylori ATCC 43504 (średnia wartość MIC: 95 µg/ml) i średnią wartość MIC dla szczepu klinicznego Helicobacter pylori 132/194 (średnia wartość MIC: 140 µg/ml). Wartości te uznano za graniczne.Związki dla których wartości MIC były ≥ 95 µg/ml i ≥ 140 µg/ml uznano za słabiej działające (związki numer 1 i 5). Natomiast za najlepiej działające związki uznano te dla których wartości MIC były poniżej wyznaczonej średniej czyli ≤ 95 µg/ml i ≤ 140 µg/ml, gdyż hamowały wzrost H. pylori w niskim stężeniu. Taką aktywność odnotowano dla związków o numerach: 2, 4, 8, 10–16, 18, 20 i 23 (57% badanych związków).W dokonanej analizie budowy strukturalnej badanych związków wykazano zależność między ich strukturą a aktywnością wobec H. pylori. Na podstawie wartości MIC wyróżniono układy i/lub podstawniki odpowiedzialne za potęgowanie i częściową utratę aktywności badanych pochodnych ksantonu i kwasu cynamonowego. Wykazano, że silne działanie przeciwbakteryjne związków wywołane było obecnością jednego z następujących układów: piperazyny, cykloheksanonu, cykloheksanolu. Natomiast wprowadzenie do układu ksantonu ugrupowania izopropylowego lub dwóch grup hydroksylowych odpowiedzialne było za spadek aktywności badanych związków. Przeprowadzone badania miały charakter skriningowy. Pozwalają wstępnie wnioskować o obecności ugrupowań chemicznych wzmagających aktywność przeciwbakteryjną. Kolejny etap badań powinien obejmować dalszą modyfikację chemiczną pochodnych ksantonu i kwasu cynamonowego w celu uzyskania jak największej aktywności badanych związków w stosunku do H. pylori.

About half of the world's population is estimated to be infected with Helicobacter pylori (H. pylori), a pathogen that infects the stomach and produces inflammation that is responsible for the development of duodenal ulcer, peptic ulcer, gastric cancer and mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma.Despite the effort of the European Helicobacter Study Group to provide the best treatment schemes H.pylori eradication is not achieved in each case. The major cause of therapy failure is H.pylori resistance to currently available antibiotics and chemotherapeutics. Especially concerning is globaly increasing resistance to metronidazole and clarithromycin – two main antimicrobial agents used in the therapy of H.pylori infection. As the eradication rates are progressively decreasing, in order to be able to provide successful treatment there is a need for the discovery of s novel, potent antibacterial agent.We examined the activity of 23 aminoalkanole derivatives based on the structure of xanthone or cinnamic acid against two strains of H.pylori (Helicobacter pylori ATCC - strain resistant to metronidazol and Helicobacter pylori 132/194 - strain resistant to clarithromycin). The examined compounds were synthesized in the Department of Bioorganic Chemistry at the Faculty of Pharmacy at Jagiellonian University Medical College in Cracow under the supervision of Prof. H. Marona.Anti-H.pylori activity of tested aminoalkanole derivatives was determined based on disc diffusion procedure by measuring the size of the inhibition zone produced by examined substances. Compounds were tested in an quantitative assay at the concentrations of: 10 mg/ml; 5 mg/ml; 1 mg/ml; 500 µg/ml; 200 µg/ml; 150 µg/ml; 100 µg/ml; 75 µg/ml; 50 µg/ml; 10 µg/ml to establish the lowest concentration that inhibits growth of the H.pylori strain (Minimal Inhibitory Concentration, MIC). All of tested compounds were active against both H.pylori strains at the concentration of 10 mg/ml; 5 mg/ml; 1 mg/ml; 500 µg/ml (with the exception of compound number 17). Whereas, MIC of aminoalkanole derivatives ranged from 500 µg/ml to 10 µg/ml. In order to quantitatively analise anti-bacterial activity of tested compounds the mean MIC value was calculated (Helicobacter pylori ATCC MIC mean value 95 µg/ml, Helicobacter pylori 132/194 MIC mean value 140 µg/ml).Compounds which expressed MIC ≥ 95 µg/ml and ≥ 140 µg/ml were regarded as less active (compound number 1 and 5). Whereas, compounds which expressed MIC ≤ 95 µg/ml and ≤ 140 µg/ml were considerd to have the best antibacterial activity (compounds number: 2, 4, 8, 10–16, 18, 20 i 23).Performed structure - activity study revealed that the chemical structure of compound plays a role in the antibacterial activity. Based on MIC values structures and moieties, which increase anti-H.pylori activity were determined (piperazine, cyclohexanol, cyclohexanone moiety). Isopropyl moiety and two hydroxyl groups in the side chain of xanthone derivative were responsible for the partial loss of antibacterial activity.The study allowed to draw preliminary conclusions on favorable substitutions and chemical groups in the xanthon and cinnamic acid structures that are responsible for the antibacterial activity. High anti-H.pylori activity of tested aminoalkanole derivatives confirms the significance of further research and gives hope to obtain a compound that can be successfully used in the eradication of H.pylori.