Produkcja ludzkich rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych specyficznych względem VEGF-C z zastosowaniem metody ekspresji fagowej

VEGF-C (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego C) to prolimfangiogenny czynnik pełniący kluczową rolę w tworzeniu nowych naczyń limfatycznych. W wyniku limfangiogenezy towarzyszącej guzom złośliwym, naczynia limfatyczne stają się drogą rozsiewu dla komórek nowotworowych migrujących z pierwotnego środowiska do innych narządów i tkanek w organizmie. Zablokowanie osi sygnałowej pomiędzy VEGF-C a jego receptorami VEGFR-2 oraz VEGFR-3 wydaje się być ważnym elementem terapii antylimfangiogennej. Celem niniejszej pracy było otrzymanie fragmentów przeciwciał monoklonalnych formatu scFv specyficznie rozpoznających mysi i ludzki VEGF-C. Za pomocą techniki ekspresji fagowej z biblioteki fagemidowej fragmentów ludzkich przeciwciał Tomlinson J wyselekcjonowano 15 fagów wiążących VEGF-C. Analiza bioinformatyczna sekwencji kodujących wyodrębnione przeciwciała pozwoliła na zidentyfikowanie 13 unikalnych sekwencji scFv. Prawie wszystkie rekombinowane przeciwciała zawierały w obrębie regionów hiperzmiennych kodon amber, uniemożliwiający ich produkcję w szczepie niesupresorowym. W celu wymiany kodonu amber przeprowadzono mutagenezę ukierunkowano metodą QuikChange wybranych sekwencji scFv. Ostatecznie wszystkie sekwencje kodujące przeciwciała wklonowano do wektora pET_scFv, a do ekspresji wykorzystano supresorowy szczep bakterii RosettaBlue(DE3)pLysS. Obecnie trwają prace nad optymalizacją ekspresji przeciwciał oraz testowaniem ich właściwości hamujących aktywność biologiczną mysiego VEGF-C.

VEGF-C (vascular endothelial growth factor C) is a key prolymphangiogenic molecule in development of new lymphatic vessels. Tumor lymphangiogenesis generates pathways for cancer cells invasion of intact tissues and organs. Thus, blocking of signal transmission between VEGF-C and its receptors VEGFR-2 and VEGFR-3 seems to be a crucial element of antylymphangiogenic therapy. The main goal of this Master Thesis was to obtain single chain variable fragments of monoclonal antibodies (scFv) specific to murine and human VEGF-C. With usage of phage display technology 15 phages binding VEGF-C have been selected from human single-fold scFv library (Tomlinson J). 13 unique sequences of scFv were identified by bioinformatic analysis. Almost all recombinant antibodies had amber codon included in hipervariable region, which disabled their production in non–suppressor strain. In order to exchange the amber codon site-directed mutagenesis by QuikChange method was performed for few chosen scFvs. Finally, all sequences coding antibodies were clonned into pET_scFv vector and expressed in RosettaBlue(DE3)pLysS suppressor strain. Opimalization of antibodies expression and investigation of inhibitory effect of obtained scFvs on murine VEGF-C biological activity are currently performed in our laboratory.