Wykorzystanie sączenia molekularnego i wygaszania fluorescencji do badania oddziaływania jonów cynku z N-końcową domeną białka YY1

Białko Yin Yang 1 (YY1) jest wielofunkcyjnym czynnikiem transkrypcyjnym,którego domena transaktywatorowa (TAD) znajduje się na N-końcu. Dla ludzkiej formytego białka domena ta odejmuje fragment białka od 1 do 295 reszty aminokwasoweji cechuje się wysokim stopniem nieuporządkowania struktury. W sekwencjiaminokwasowej TAD znajduje się homopolimer 11 reszt histydynowych obejmującychfragment od 70 do 80 reszty aminokwasowej i rozdzielający fragmenty o dużejzawartości reszt o ładunku ujemnym. Ponieważ reszty His mają zdolność koordynacjijonów dwuwartościowych postanowiono zbadać wpływ jonów cynku na strukturyzacjęN-końcowej białka YY1.W ramach poniższej pracy wykonano dwa konstrukty zawierające pełnej długościbiałko YY1 oraz N-kocową domenę białka YY1 (YY1-TAD), a także opracowanoprotokół wydajnej ekspresji białka YY1-TAD. Chcąc określi wpływ jonów cynku nazmiany struktury łańcucha aminokwasowego YY1-TAD oraz określenia udziału w tymprocesie homopolimeru histydynowego wykorzystano metody sączenia molekularnegooraz wygaszania fluorescencji. W wyniku przeprowadzonych badań określono, że jużniewielki dodatek cynku (5μM – 0,6 cząsteczki Zn2+/YY1-TAD) powodujestrukturyzację TAD i zmniejszenia promienia hydrodynamicznego, przy dalszymzwiększaniu stężenia cynku obserwuje się dimeryzację białka, następnie oligomeryzacjęi tworzenie się agregatów oraz strontów. Stosując różne warunki pomiarów potwierdzono, że za dimeryzację białkaodpowiedzialne są reszty histydynowe, natomiast mechanizm oligomeryzacjii tworzenia agregatów jest inny.

The Ying Yang 1 is multifunctional transcription factor, which transactivatordomain (TAD) is located on N-terminus. For human form of the protein comprises ina fragment from 1st to 295th amino acid residues, which structure is highly disorderd.There is homopolymer of 11 hisitidine residues in aminoacid sequence of TADincluding a fragment of 70 to 80 amino acid residues, which separates two parts ofa high content of negatively charged residues. Since histidine residues have the abilityto coordinate divalent ions, we decided to investigate effects of zinc ions on thestructuring of YY1 N-terminus.In this paper constructs containing the full-length protein YY1 and N-terminaldomain of protein YY1 (YY1-TAD) were made, and also an efficient protocol forYY1-TAD expression was developed. To determine the effect of zinc ions on changes inthe structure of the amino acid chain of YY1-TAD and to determine the role ofhistidine homopolymer in this process the size exclusion chromatographyand fluorescence quenching ware used. The research specified that evena small addition of zinc ions (5μM - 0.6 molecules of Zn2+ per one YY1-TAD) causesTAD structuration and reduce the hydrodynamic radius. With further increasing of zincions concentration the dimerization of the protein, followed by oligomerizationand formation of aggregates and precipitate is observed. Using various measurementconditions it was confirmed that the histidine residues may be responsible for proteinsdimerization, while the mechanism of oligomerization and aggregation is different.