Ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja pochodnych wariantu I56F oraz L58F-V92Y wołowej β-laktoglobuliny

Nowadays in the case of drug poisoning, it is more common to use a blood purification techniques e.g. albumin dialysis, instead of the standard treatment. Unfortunately, this technique has some limitations. β-Lactoglobulin, a protein from lipocalin family, could potentially be used in dialysis systems due to the ability to bind a different kind of ligands. The purpose of the study was expression, isolation, purification and crystallization of derivatives of I56F and L58F-V92Y of β-lactoglobulin mutants and analysis of crystal structures and their complexes with selected ligands.New variants of β-lactoglobulin were produced in Origami B(DE3) cells. Proteins were purified using ion-exchange and size-exclusion chromatography. Crystallization was carried out by hanging drop technique. Low-temperature X-ray data collection were performed using a CuKα radiation (1.54 Å). Determined crystal structures of the new lactoglobulin variants and their complexes with ligands (2.00-2.40 Å) have symmetry of the P3221 space group. They showed that the mutation at position 39 combined with substitutions of residues 58 and 92 favors the binding tolbutamide and only certain antidepressants in the β-barrel. In contrast, mutations 39-56 and 39-56-107 favor binding tricyclic antidepressants.

Coraz częściej w przypadku zatruć lekami zamiast standardowego leczenia, stosuje się inne techniki oczyszczania osocza krwi np. dializę albuminową. Niestety technika ta ma pewne ograniczenia. Białka z rodziny lipokalin, do których należy też β-laktoglobulina, mogłyby potencjalnie znaleźć zastosowanie w systemach dializacyjnych, ze względu na zdolność do wiązania wielu ligandów.Celem pracy było otrzymanie oraz wykonanie badań strukturalnych pochodnych wariantu I56F oraz L58F-V92Y wołowej β-laktoglobuliny oraz analiza otrzymanych struktur pod kątem zmian w budowie miejsca wiążącego oraz zdolności do tworzenia specyficznych oddziaływań z wybranymi ligandami. Nowe warianty laktoglobuliny produkowano w komórkach Origami B(DE3), białka oczyszczano za pomocą chromatografii jonowymiennej oraz sączenia molekularnego. Krystalizację prowadzono techniką wiszącej kropli. Niskotemperaturowe pomiary dyfraktometryczne wykonywano przy użyciu promieniowania CuKα (1.54 Å). Wyznaczone struktury nowych wariantów białka oraz ich kompleksów z ligandami (2.00-2.40 Å) miały symetrię grupy przestrzennej P3221. Ujawniły one, że mutacja w pozycji 39, połączona z odpowiednimi substytucjami reszt 58 oraz 92 sprzyja wiązaniu w β-baryłce tolbutamidu oraz tylko niektórych antydepresantów. Natomiast mutacje 39-56 oraz 39-56-107 sprzyjają wiązaniu trójcyklicznych leków antydepresyjnych.