Otrzymanie bakulowirusów kodujących białka strukturalne HCoV-NL63 i optymalizacja ekspresji

Human coronavirus NL63 is responsible for usually mild, or sometimes moderate infections of the upper and lower airways. Previous work has identified four structural proteins constituting the viral envelope: E, M, S, and ORF3. In addition, the N protein in a complex with the viral RNA forms the core of the virion. Using the structural proteins of the virus, virus-like particles were obtained. Those non-infectious structures resemble in shape and size the complete virus particle. In the present work, by the usage of a baculovirus expression system, the production of viral proteins iin insect cells was achieved and the expression conditions were optimized. In the next stage of work an attempt to create a virus-like particle was made. Studies were conducted using techniques such as Western blotting and imaging by fluorescence microscopy. Obtained virus-like particles were purified by ultracentrifugation in density gradient. For final verification, whether virus-like structures are formed, transmission electron microscopy was employed.

Ludzki koronawirus NL63 jest odpowiedzialny za infekcję górnych i dolnych dróg oddechowych zazwyczaj o łagodnym lub umiarkowanym przebiegu. Wcześniejsze prace pozwoliły zidentyfikować cztery białka strukturalne tworzące otoczkę wirusową: E, M, S oraz ORF3. Dodatkowo białko N w kompleksie z wirusowym RNA tworzy rdzeń wirionu. Wykorzystując białka strukturalne wirusów można otrzymać cząsteczki wirusopodobne, czyli niezakaźne struktury przypominające kształtem i wielkością wirusa. W niniejszej pracy, wykorzystując bakulowirusowy system ekspresji uzyskano produkcję białek wirusowych w komórkach owadzich i przeprowadzono optymalizację warunków ekspresji. W kolejnym etapie pracy podjęto próbę stworzenia cząsteczek wirusopodobnych. Badania prowadzone były z wykorzystaniem takich technik jak Western blot i obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Uzyskane cząsteczki wirusopodobne oczyszczano poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości. W celu ostatecznej weryfikacji, czy dochodzi do tworzenia struktur wirusopodobnych przeprowadzono obrazowanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.