Ekspresja in vitro białek oddziałujących z chlorofilem

Podstawową biotechnologiczną metodą otrzymywania białek jest ich nadekspresja in vitro w systemie prokariotycznym lub eukariotycznym. Dobór systemu ekspresji zależy od struktury białka, jego właściwości i pełnionej funkcji. Celem niniejszej pracy było porównanie dwóch systemów ekspresji białek membranowych, transportera BCRP i apoproteiny lhcb1 anteny fotosyntetycznej LHCII. BCRP rozpoznaje i transportuje pochodne chlorofilu w komórkach zwierzęcych. Białko lhcb1 tworzy z chlorofilem kompleks LHCII należący do PSII. Ekspresję BCRP przeprowadzono w komórkach owadzich, wykorzystując bakulowirusy. Wpierw utworzono plazmid zawierający gen BCRP, a potem aktywne jednostki wirusowe, których replikacja w komórkach owadzich prowadzi do ekspresji BCRP. Do identyfikacji BCRP użyto metody Western-blotting. Białko lhcb1 otrzymano przez ekspresję w E. coli szczepu JM101. Po indukcji IPTG produkty białkowe rozdzielono elektroforetycznie (SDS-PAGE) i oznaczono metodą Bradforda. Przeprowadzono rekonstytucję białka rekombinowanego i natywnego z barwnikami fotosyntetycznymi. Metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy i elektroforetyczną (LDS-PAGE) potwierdzono tworzenie monomerycznego LHCII. Widma absorpcji elektronowej, dichroizmu kołowego i fluorescencji potwierdziły uzyskanie w pełni funkcjonalnych monomerycznych kompleksów LHCII.

The basic biotechnological method of obtaining proteins is in vitro overexpression in a prokaryotic or eukaryotic system. The selection of the expression system depends on the structure of the protein, it is properties and function. The aim of this study was to compare the two systems expression of two membrane proteins, the BCRP transporter and apolipoprotein lhcb1 of LHCII photosynthetic antena. BCRP recognizes and transports the derivatives of chlorophyll in animal cells. Lhcb1 protein forms a complex with chlorophyll LHCII belongs to PSII. BCRP expression was carried out in insect cells using baculoviruses. First, a plasmid was created containing the BCRP gene, then created active viral units whose replication in insect cells induce to the expression of BCRP. Western blotting was used to identify BCRP. The lhcb1 protein was obtained by expressing it in the E. coli cells strain the JM101. After the induction with IPTG, the protein products were separated by electrophoresis (SDS-PAGE) and determined by the Bradford method. Next, the reconstitution of the recombinant and native proteins with photosynthetic pigments was attempted. The formation of monomeric LHCII complex was confirmed by sucrose density-gradient ultracentrifugation and electrophoretic method (LDS-PAGE). The absorption and circular dichroism spectra, and fluorescence emission confirmed the formation of fully functional monomeric LHCII complexes.