Wykorzystanie IX systemu sekrecji jako narzędzia do ekspresji zewnątrzkomórkowej znakowanych białek w bakterii Porphyromonas gingivalis

Porphyromonas gingivalis jest gram ujemną i obligatoryjnie beztlenową bakterią należącą do klasy Bacteroidetes. Bakteria ta jest komponentem mikroflory jamy ustnej i zaangażowana jest w patogenezę paradontozy, czyli chronicznej choroby przyzębia. Podczas badań nad Bacteroidetes odkryto nowy system wydzielania białek i nazwano go IX systemem sekrecji. Służy on do sekrecji czynników wirulencji, które są niezwykle istotne w rozwoju choroby przyzębia. Aby białko mogło zostać przetransportowane przez ten system musi zawierać peptyd sygnalny w postaci domeny C-terminalnej (CTD), gdyż w przeciwnym razie będzie akumulowane w peryplazmie. Domenę tę poprzedza domena IgSF (Immunoglobulin-superfamily domain), która ma strukturę charakterystyczną dla nadrodziny immunoglobulin. Najlepiej scharakteryzowanym substratem T9SS jest białko RgpB. Celem niniejszej pracy było uzyskanie szczepów P. gingivalis zdolnych do zewnątrzkomórkowej sekrecji białka PorU, która umożliwi uzyskanie i oczyszczenie fragmentów białka PorU w formie natywnej. W tym celu, stworzono białko fuzyjne, poprzez podmianę domeny CTD lub IgSF-CTD z białka RgpB w obrębie sekwencji białka PorU. Wprowadzono znacznik 6His między domeny IgSF oraz CTD, co umożliwiło wyznakowanie białka. Nie uzyskano jednak białka PorU-cargo w pożywce pohodowlanej w zadawalającym stężeniu, które umożliwiłoby jego oczyszczenie w formie natywnej.

Porphyromonas gingivalis is a gram negative, obligate anaerobic bacterium belonging to the Bacteroidetes phylum. This bacterium is a component of the oral microflora and is involved in the pathogenesis of periodontitis, chronic periodontal disease. During research on Bacteroidetes, a new protein secretion system was discovered and was called the IX secretion system (T9SS). T9SS is responsible for the secretion of virulence factors which are extremely important in the periodontal disease development. Protein substrates transported through T9SS contain a signal peptide in the form of a C-terminal domain (CTD), otherwise they accumulate in the periplasm. The CTD is preceded by the IgSF (Immunoglobulin-superfamily domain). The best-characterized T9SS substrate is the RgpB protein. The aim of presented work was to obtain strains of P. gingivalis capable of extracellular secretion of PorU protein, which will enable purification of PorU in its native form. A fusion protein was created by substituting the sequences of the CTD or IgSF-CTD domains in PorU for their RgpB homologs. The hexahistidine-tag was inserted between the IgSF and CTD domains. However, despite the performed modifications PorU-cargo protein was not secreted to the medium in a satisfactory amount.