Reconstitution of Elongator complex in insect cells using biGBac system

Metoda Gibson Assembly została opisana przez dr Daniela G. Gibsona w 2009 roku, umożliwia tworzenie konstruktów ekspresyjnych zawierających do 25 genów i może być wykorzystywana w różnych systemach ekspresyjnych. Po oflankowaniu odpowiednimi sekwencjami flankującymi, kasety zawierające poszczególne geny są wykorzystywane do właściwej reakcji, która bazuje na izotermalnej aktywności 3 enzymów: 5’-egzonukleazy, polimerazy DNA oraz ligazy DNA. Metoda jest używana do rekonstytucji in vitro złożonych kompleksów białkowych. Kompleks Elongatora jest wysoce konserwatywnym ewolucyjnie kompleksem eukariotycznym, zbudowanym z dubletu 6 podjednostek. Jest zorganizowany w dwa stabilne termodynamicznie podkompleksy: Elp123 o właściwościach katalitycznych i mElp456 odpowiadającym za wiązanie tRNA. Kompleks Elongatora jest odpowiedzialny z modyfikowanie tRNA, przez co jego aktywność pośrednio reguluje ekspresję genów. Mutacje punktowe w obrębie podjednostek kompleksu, zaburzające jego prawidłowe funkcjonowanie są przyczyną trudnych w leczeniu schorzeń neurologicznych oraz nowotworowych.Celem niniejszej pracy było otrzymanie konstruktu ekspresyjnego zawierającego pełnej długości geny kompleksu Elongatora ich ekspresja w systemie BEVS (Baculovirus Expression Vector System). Dzięki zastosowanym metodom, z sukcesem otrzymano niezbędne konstrukty i przeprowadzono ekspresję oraz oczyszczanie stabilnego podkompleksu Elp456.

Gibson Assembly is a novel cloning method developed by Daniel G. Gibson in 2009. The technique allows to build multi-gene constructs consist of up to 25 genes that can be co-expressed in different expression systems. In detail, genes of interests are firstly cloned into special intermediate vectors and subsequently, the appropriate overhanging DNA fragments are added using polymerase chain reaction (PCR). The main reaction requires isothermal activity of three enzymes: 5’-exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase. The Gibson Assembly method is highly useful for in-vitro reconstitution of multi-protein complexes for structural and mechanistic studies which are one of the most powerful tools to shad a light on molecular details of cells functioning.Elongator is highly conserved protein complex built of 6 subunits in two copies. Each copy contains 2 independent subcomplexes: Elp123 and Elp456. Appropriately folded and assembled elongator complex is very important in normal functioning of eukaryotic cells and point mutations in its subunits can cause severe diseases connected with neural system, cancer and mitochondrial dysfunctions. Recent reports indicate that among various functions of Elongator complex, its key role in the metabolism of the cell is regulation of genes expression by modifying tRNA.The aim of this work was preparation of the construct consisting all full length mammalian elongator proteins genes and then use the Baculovirus Expression Vector System in order to express the reconstituted Elongator complex. Multi-protein complex was purified using affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. This approach enabled expression of first full-length mammalian Elongator subcomplex (Elp456) and successful purification for further biochemical and structural studies.