An attempt to develop an expression system for the recombinant form of bacteriocin naturally encoded in pMW2 plasmid in Staphylococcus aureus

Bakteriocynami nazywa się białkowe lub peptydowe toksyny, wytwarzane przez różne gatunki bakterii w celu zahamowania wzrostu blisko spokrewnionych organizmów. Substancje te są mocno zróżnicowane zarówno strukturalnie jak i funkcjonalnie. Obecnie badana jest przydatność ich stosowania w przemyśle spożywczym. Wyróżnia się 4 podstawowe klasy bakteriocyn i na podstawie właściwości fizykochemicznych odpowiednio się je kwalifikuje. Gen kodujący bakteriocynę Lcn972_Sa występuje w plazmidzie pMW2 Staphylococcus aureus. Jest ona homologiczna względem laktokokcyny 972 z Lactococcus lactis D1, która już wcześniej została scharakteryzowana. Przedmiotem tej pracy było otrzymanie rekombinowanej formy bakteriocyny Lcn972_Sa z S. aureus ch24 w systemie ekspresyjnym opartym o Escherichia coli. Przygotowanie konstruktu DNA rozpoczęto od izolacji plazmidu pMW2 i amplifikacji genu lcn972_sa. Równocześnie wykonano izolację plazmidu ekspresyjnego pETDuet-1. Produkt PCR oraz oczyszczony plazmid poddano działaniu enzymów restrykcyjnych celem utworzenia lepkich końców. Następnie przystąpiono do reakcji ligacji oraz transformacji bakterii E. coli Top10 mieszaniną ligacyjną, po czym badano poprawność wykonanego konstruktu DNA wykonując tzw. PCR z całkowitych lizatów bakteryjnych (ang. colony PCR). Analizy sekwencjonowania potwierdziły prawidłową budowę konstruktu, jednak testy ekspresji pokazały, że bakteriocyna Lcn972_Sa nie ulega ekspresji w E. coli BL21(DE3). Zjawisko preferencji kodonów jest częstym problemem spotykanym podczas produkcji rekombinowanych białek w E. coli. Analiza sekwencji genu lcn972_sa wskazała, że produkt jego transkrypcji posiada przynajmniej 4 kodony mogące negatywnie wpływać na przebieg translacji w E. coli. Zaproponowano różne strategie rozwiązania braku efektywnej ekspresji genu kodującego bakteriocynę Lcn972_Sa, do których należy zaliczyć zastosowanie takiego szczepu E. coli, który dysponuje zwiększoną pulą tRNA specyficzną wobec rzadkich kodonów, wzmocnienie transkrypcji genu lcn972_sa, sekrecję produkowanego białka do peryplazmy lub na zewnątrz komórki. Inną strategią jest zapobieganie tworzeniu ciałek inkluzyjnych które mogłyby wpłynąć na ekspresję Lcn972_Sa lub ich celowe tworzenie celem zahamowania aktywności bakteriocyny w komórce i próba renaturacji po izolacji. Syntezę Lcn972_Sa można też próbować wywołać przez złagodzenie stresu komórkowego wynikającego z nadprodukcji rekombinowanej bakteriocyny.

Bacteriocins are proteins or peptide toxins, produced by bacteria of different species in order to inhibit the growth of closely related organisms. These substances are highly diversified both structurally and functionally. The suitability of their use in the food industry is currently being investigated. There are 4 basic classes of bacteriocins and physicochemical properties is main criterium of their classification. Lcn972_Sa is a bacteriocin encoded in Staphylococcus aureus pMW2 plasmid. This protein is homologous to lactococcin 972 and it is observed in Lactococcus lactis D1, which already had been characterized. The aim of this work was to obtain the recombinant form of bacteriocin Lcn972_Sa from S. aureus ch24 in E. coli expression system. The preparation of DNA construct has been iniciated with the pMW2 plasmid isolation, amplification of lcn972_sa gene and pETDuet-1 expression plasmid isolation. Subsequently, the PCR product and the plasmid were treated by restriction enzymes to create a sticky ends. In the next step, the ligation reaction and transformation of E. coli Top10 with the ligation mixture were performed to replicate DNA construct. The construct correctness was tested by conducting colony PCR procedure. DNA sequencing analysis confirmed the structure of DNA construct was contains lcn972_sa gene, however, the expression assays showed that Lcn972_Sa was produced unefficiently in E. coli BL21(DE3). The codon bias is a common problem encountered in the production of recombinant proteins in E. coli. Sequence analysis of the lcn972_sa gene indicated the transcription product has at least 4 codons that may negatively affect the effectiveness of translation in E. coli. Various strategies have been scrutinized to solve the lack of expression of the gene encoding Lcn972_Sa bacteriocin. The usage of an E. coli strain with increased tRNA maintance for rare codons, transcription enhancement of lcn972_sa gene, extracellular or periplasm secretion of the produced protein are significant strategies in lcn972_sa expression induction. Another strategy leads to prevent the formation of inclusion bodies which could disturb the expression of Lcn972_Sa eventually their deliberate formation to inhibit bacteriocin activity inside bacteria cells and attempt to renaturation after further isolation. The alleviation of cellular stress conditions can also affect positively to bacteriocin production.