Structural and biochemical characterization of L-asparaginase from Klebsiella pneumoniae

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) mainly affects children. L-asparaginases, enzymes that hydrolyze L-Asn to L-Asp and ammonia, are commonly used in the treatment of ALL However, currently used L-asparaginases cause many side effects, and therefore new enzymes with better therapeutic parameters are highly required. The aim of the project included the biochemical and structural characterization of Class 2 L-asparaginase from Klebsiella pneumoniae (KpAIII). The protein was purified by affinity or ion-exchange chromatography. Kinetic experiments performed with the use of the Nessler method showed that KpAIII was the most active at pH 9 and the reaction was the fastest at 60°C. The determined Km value was about 49 mM. CD spectra confirmed that the protein is properly folded, while nanoDSF measurements revealed a Tm denaturation temperature of approximately 75°C. The protein was crystallized by the hanging and sitting drop technique. Initial crystallization conditions of KpAIII have been found, however, they require further optimization.

Ostra białaczka limfoblastyczną (ALL) dotyka głównie dzieci. Jednym z leków stosowanych w terapii ALL są L-asparaginazy, które rozkładają aminokwas L-Asn do L Asp oraz amoniaku. Ze względu na to, że obecnie stosowane L-asparaginazy powodują wiele skutków ubocznych, poszukuje się nowych enzymów o lepszych parametrach terapeutycznych. Celem projektu była charakterystyka biochemiczna i strukturalna L asparaginazy Klasy 2 z Klebsiella pneumoniae (KpAIII). Do oczyszczania białka wykorzystywano chromatografię powinowactwa lub chromatografię jonowymienną. Eksperymenty kinetyczne prowadzone metodą Nesslera wykazały, że KpAIII jest najbardziej aktywne w pH 9, a reakcja najszybciej przebiegała w 60°C. Wyznaczona wartość Km wyniosła ok. 49 mM. Widma CD potwierdziły, że białko jest poprawnie sfałdowane, natomiast pomiary nanoDSF wskazują na temperaturę denaturacji Tm ok. 75°C. Białko krystalizowano techniką wiszącej oraz siedzącej kropli. Ustalono również wstępne warunki krystalizacji KpAIII, wymagają one jednak dalszej optymalizacji.