α-Hydroksymetylo-α-alkiloaminokwasy należą do niebiałkowych aminokwasów α,α-dipodstawionych, których inkorporacja w łańcuch peptydowy może prowadzić do analogów o interesujących własnościach biologicznych, usztywnionej konformacji łańcucha peptydowego, zmienionym charakterze hydrofilowym i hydrofobowym oraz bardziej odpornych na hydrolizę enzymatyczną. W momencie podejmowania tej tematyki nie było opisanych w literaturze analogów peptydów biologicznie aktywnych, zwierających α-hydroksymetyloaminokwasy. Opracowano ogólną metodę oznaczania konfiguracji absolutnej a-hydroksymetyloaminokwasów polegającą na korelacji chemicznej ze znanymi α-metyloaminokwasami. Dla α-hydroksymetylowych analogów BzTyr, BzAsp i BzCys(Bzl) przeprowadzono rentgenograficzną analizę strukturalną, na podstawie której określono konfigurację absolutną oraz konformację ich N-benzoilowych pochodnych. Zsyntetyzowano szereg analogów peptydów biologicznie aktywnych zawierających reszty otrzymanych optycznie czynnych α-hydroksymetyloaminokwasów, stosując metody w roztworze i w fazie stałej. W syntezie na nośniku polimerowym użyto α-hydroksymetyloaminokwasy zarówno z chronioną, jak i wolną grupą hydroksylową. Wbudowanie dwóch reszt α-mety-loseryny w sekwencje lipopentapeptydu aktywującego limfocyty B prowadzi do analogu o wysokiej aktywności mitogennej i przedłużonym działaniu. Synteza czterech analogów LHRH, zawierających w pozycji 4 lub 6 reszty α-metyloseryny, dała związki o wysokiej aktywności biologicznej. Analog zawierający resztę (,S)-MeSer w pozycji 4 wykazywał, w przeprowadzonych testach in vivo, selektywność w uwalnianiu FSH (w dawce 1 μg uwalnia 32.5 ng/ml FSH, podczas gdy poziom uwalniania LH jest taki jak dla soli fizjologicznej). Przeprowadzono syntezę 16 analogów enkefalin zawierających reszty (R) i (S}-MeSer w pozycji 2 lub 3, dla których oznaczono aktywność antynocyceptywną. Analog dalamidu, posiadający resztę (5)-MeSer (α-hydroksymetylowaną D-Ala) w pozycji 2, wykazywał najwyższą aktywność, przy czym efekt antynocyceptywny utrzymywał się przez 180 min (100% aktywności przez 60 min). Zsyntetyzowano analogi [D-Ala2]Leu-enkefaliny i dalamidu zawierające α-hydroksymetylowe pochodne Tyr, Phe oraz Leu i poddano badaniom na wiązanie z receptorami opioidowymi. Wbudowanie HmTyr w miejsce Tyr powoduje dramatyczny spadek wiązania z receptorami μ i δ. Inkorporacja HmPhe w pozycję 4, HmLeu w pozycję 5 oraz przedłużenie łańcucha enkefaliny o resztę HmPhe prowadziła w większości przypadków do analogów o wysokim powinowactwie do receptorów μ i δ. Analogi zawierające α-hydro-ksymetyloaminokwasy o konfiguracji (R) w pozycji 4 i 5 posiadały wyższe powinowactwo w stosunku do receptora μ. Analogi zawierające (S) enancjomer w tych pozycjach oraz o przedłużonej sekwencji wykazywały selektywność w stosunku do receptora δ. Zbadano wpływ charakteru amfifilowego α-hydroksymetyloaminokwasów na aktywność biologiczną analogów deltorfiny I i endomorfmy-2. Wbudowanie (S)-HmPhe w pozycję 3 deltorfiny I dało analog o zbliżonej aktywności do naturalnego neuropeptydu, natomiast analog zawierający (R)-HmVal w pozycji 5 wykazywał wyższe powinowactwo w stosunku do receptora δ i selektywność niż deltorfma I. Modelowanie molekularne wykazało, że tylko analogi zawierające (S)-HmPhe w pozycji 3 lub (R)-HmVal w pozycji 5 stabilizują postulowaną, biologicznie aktywną konformację "hot-dog shape". Zsyntetyzowano 6 analogów endomorfiny-2, w których reszty Tyr lub Phe zostały zastąpione HmTyr lub HmPhe. Otrzymane tetrapeptydy posiadały niższe powinowactwo do receptora μ. Podobnie jak naturalna endomorfina-2, wykazywały selektywność w stosunku do receptora μ, co wskazuje na analogię topografii farmakoforów. Wbudowanie (R)-HmPhe w pozycję 3 analogów argininowej wazopresyny prowadziło do zaniku czynności biologicznej w teście presyjnym i teście na aktywność skurczową macicy. Aktywność analogu [Mpa1,(R)-HmPhe3]AVP w teście antydiuretycznym otwiera nowe możliwości w projektowaniu V2 agonistów. Przedstawione badania nad wpływem amfifilowych -α hydroksymetyloaminokwasów na własności peptydów biologicznie aktywnych należą do nielicznych opisanych w literaturze. Do chwili obecnej ukazały się trzy prace pochodzące z innych laboratoriów poświęcone tej tematyce.
α-Hydroxymethyl-α-alkylamino acids belong to the family of α,α-dialkyl amino acids, which are an useful replacement of coded amino acids, because of their strong secondary-promoting effects and the increased pro-teolytic stability of the resulting peptides. One can expect, that besides generating specific constrains on conformational freedom of the peptide chain α-hydroxymethyl-α-alkylamino acids would furnish peptides with enhanced hydrophilicity advantageous for an increase of bioavailability. In spite of their potential as a peptide building block, α-hydroxymethyl-α-alkylamino acids remain neglected by peptide chemists and only few examples of their use in structure-activity studies have been reported so far. In the present research a general method of determination the absolute configuration of α-hydroxymethylamino acids were developed. The method involves a chemical correlation with α-methylamino acids. The absolute configuration were determined for HmPhe, HmPhg, HmVal, HmLeu, HmLys, HmNal and HmEtGly. Also the absolute configurations of HmTyr, HmAsp and HmCys were determined from X-ray structure of their benzoyl derivatives. Both enantiomers of α-hydroxymethylamino acids with free or protected hydroxymethyl group were incorporated into several bioactive peptides using methods in solution as well as on polymer support. The lipopentapeptide Pam3Cys-(R)-MeSer-(R)-MeSer-Asn-Ala was synthesized in order to obtain a mitogenic lipopeptides resistant against proteases. The analogue with (R)-MeSer was found to induce enhanced cell proliferation of spleen lymphocytes. Four analogues of LHRH containing both enantiomers of MeSer in position 4 or 6 were synthesized. The most interesting result was selective release of FSH by the analogue containing (S)-MeSer in position 4. The influence of the amphiphilic character of α-hydroxymethylamino acids on the biological activity of opioid peptides was studied. The analogues of Leu- and Met-enkephalines containing α-hydroxymetylated amino acid in each position were synthesized. These analogues were tested on antinociceptive activity and binding affinity. The most interesting analogue of dalamide (Tyr-(S)-MeSer-Gly-Phe-LeuNH2) produced an antinociceptive effect between 10 to 180 min. after injection, with the peak effect between 20 and 60 min, The investigation of binding affinity showed that the analogues containing (R)- α-hydroxymethylamino acid residue in position 4 or 5 indicate μ-selectivity. The analogues containing the (S)-enantiomer and the analogues extended with HmPhe showed δ-selectivity. The impact of α-hydroxymetylation on the binding affinity was tested for deltorphin I and endomorphin-2 analogues. The most active analogue, [(R)-HmVal 5]DT I showed δ-affinity and the selectivity higher then the parent DT I. The obtained data additionally support the previously proposed model of the active conformation of deltorphins. Three new analogues of arginine vasopressin containing (R)-HmPhe in position 3 were tested for vasopressor and antidiuretic as well as uterotonic activity. None of the analogues showed any pressor and uterotonic activity. The analogue [Mpa1, (R)-HmPhe3]AVP exhibited significant antidiuretic activity, which may offer new possibilities in the design of V2 agonists. Overall results show, that hydroxymethylation of α-position of amino acids represents modification, which could be successfully applied for SAR study of the bioactive peptide analogues.
