Isolation and transduction of murine embrional fibroblasts to obtain induced pluripotent stem cells

Komórki pluriptentne (PS) wydają się być przyszłością medycyny regeneracyjnej. Jednak ich pozyskiwanie rodziło tak wiele problemów i kontrowersji, że wydawało się, iż na wdrożenie technik opartych na PS potrzeba będzie jeszcze wielu dziesięcioleci. Dopiero w 2006 roku opracowano technologię umożliwiającą przeprogramowywanie komórek somatycznych i stworzenie pierwszych indukowanych komórek pluripotentnych (IPS) z wykorzystaniem zaledwie czterech genów. Obecnie IPS otworzyło zupełnie nowe perspektywy badań nad wykorzystaniem komórek pluripotentnych.Głównym celem tej pracy było zoptymalizowanie warunków otrzymywania warstwy odżywczej, tworzonej na bazie inaktywowanych mitotycznie MEF. Dodatkowym celem pracy było zoptymalizowanie technik pozwalających na wytworzenie oraz wyprodukowanie wektora lentiwirusowego, zdolnego do zakażenia i wprowadzenia genów Sox2, c-Myc, Oct4 i Klf4 do komórek mysich embrionalnych fibroblastów (MEF), pozwalając na wytworzenie IPS. W pierwszej fazie doświadczeń dobrano warunki izolacji i hodowli MEF oraz mrożenia/rozmrażania tych komórek, tak aby uzyskać jak najwyższą żywotność i adhezję.W toku dalszych badań ustalono warunki pozwalające na inaktywację MEF przy pomocy mitomycyny c. W rezultacie otrzymano komórki pozbawione zdolności podziałowej, ale zachowujące wysoką żywotność, nawet po upływie sześciu tygodni od założenia hodowli.W kolejnych eksperymentach, wykonano transfekcję komórek linii 293FT plazmidem pCMV-dR8.2 dvpr oraz plazmidem eGFP@pLENTI6/CMV. Komórki MEF zakażone wirusem wytworzonym przez komórki zawierające plazmid eGFP@pLENTI6/CMV wykazywały zieloną fluorescencję, było to potwierdzeniem skuteczności przeprowadzonej transfekcji, jak również dowodem, że są one zdolne do produkcji wirusa. Komórki MEF zakażono również wirusem wytworzonym przez komórki zawierające plazmid pCMV-dR8.2 dvpr. Jednakże nie uzyskano bezpośrednich dowodów na przeprogramowanie komórek MEF. Wymaga to przeprowadzenia dalszych badań.

Pluriptent cells (PS) seem to be the future of regenerative medicine. However, its isolation usually rise so many problems and controversies that can delay PS-based techniques usage. However, in 2006 the and technology allowing production of the first induced pluripotent cells (IPS) was created. Currently, IPS has opened a whole new perspective of research on the use of pluripotent cells.The aim of this study was to optimize the conditions for feeding layer production, created on the basis of mitotically inactivated MEF. An additional objective of the study was to optimize techniques allowing production of lentiviral vector capable of introducing gene Sox2, c-Myc, Oct4 and Klf4 into mouse embryonic fibroblast cells (MEF) and thus, producing IPS. In the first phase of the experiments MEF isolation and culture conditions as well as freezing/thawing conditions was optimized. In subsequent stage the inactivation of MEF with mitomycin c was successfully established. As a result mitotically inactivated MEF was created, maintaining viability even at the end of the of sixth week of the experiment.Additionally, transfection of 293FT cells with eGFP@pLENTI6/CMV plasmid reveals strong fluorescence in cells after just 24 hours. Moreover, MEFs transduction with lentiwirus produced by transfected 293FT cells was also successful and green fluorescence was also observed in transduced MEF cells. Therefore, we assume that 293FT cells transfection with pCMV-dR8.2 dvpr also occurs and efficient lentivirus production was established. Thus, the final result of this work is lentiviral vector ready for MEFs transduction and IPS generation.