Otrzymywanie aktywnego biologicznego mysiego VEGF-C w systemie BaculoDirect

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego C (VEGF-C; ang. vascular endothelial growth factor C) jest kluczowym białkiem regulującym tworzenie naczyń limfatycznych zarówno w trakcie rozwoju embrionalnego jak i w procesach regeneracyjnych w dojrzałym organizmie. Odpowiada on także za kształtowanie unaczynienia limfatycznego na etapie progresji guzów, co ułatwia późniejsze rozproszenie komórek nowotworowych, które nabyły zdolność do przerzutowania. Niniejsza praca miała na celu opracowanie metody ekspresji i oczyszczania rekombinowanego mysiego VEGF C, który wykazywałby aktywność biologiczną. Mając na uwadze, że VEGF-C jest wydzielniczą glikoproteiną, do jego produkcji zdecydowano się wykorzystać system ekspresyjny oparty o komórki owadzie oraz wektor bakulowirusowy BaculoDirect™. Po skonstruowaniu zrekombinowanego bakulowirusa, który zawiera w swoim genomie sekwencję kodującą VEGF-C kontrolowaną promotorem poliedryny, przeprowadzono optymalizację warunków ekspresji produkowanego białka. W kolejnym etapie dobrano warunki jego oczyszczania z wykorzystaniem chromatografii chelatującej na złożu niklowym. Aktywność biologiczna wyprodukowanego VEGF-C została potwierdzona w kilku niezależnych testach, w których wykazano jego zdolność do aktywacji specyficznych dla niego receptorów: VEGFR 2 oraz VEGFR 3. Opracowana metoda produkcji rekombinowanego VEGF-C została poddana walidacji i pozwala na otrzymywanie do 0,8 μg czystego białka z hodowli 1 mln komórek linii Tn-5.

Vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) is a crucial protein which regulates lymphangiogenesis during embryonic development and tissue regeneration in mature organism. It also induces lymphatic vessels formation in tumors, which facilitates dissemination of neoplastic cells and metastasis. The aim of this project was to develop highly efficient methods for expression and purification of biologically active VEGF-C. Concerning properties of the target (secreted glycoprotein), baculovirus expression vector system BaculoDirect™ was utilized. After generation of recombinant baculovirus, in which polihedrin locus was displaced by sequence coding for VEGF-C, several small-scale tests were performed in order to optimize the protein expression. Immobilised metal affinity chromatography (IMAC) purification protocol was subsequently developed. Many independent experiments have confirmed, that produced recombinant VEGF-C activates its specific receptors: VEGFR-2 and VEGFR-3. The developed recombinant VEGF-C production method was validated and allows to obtain up to 0,8 μg of pure protein from 1 million of Tn-5 cells.