Wpływ mutacji na zdolność wiązania ligandów przez nowe warianty beta-laktoglobuliny posiadające modyfikacje w rejonie wejścia do beta-baryłki

The aim of this project was expression, purification and structural studies of new β-lactoglobulin variants, possessing mutations at the entrance to the β-barrel. The new variants used in this study possessed mutations: L39K, L39Y, E62R, E62K and L39Y-M107L. Proteins were expressed in Origami B(DE3) cells. The bacterial cells were disrupted by sonication. Proteins were purified by an ion exchange and size-exclusion chromatography. Proteins and their complexes with model ligands (myrystic acid, tetracaine) were crystallized by hanging-drop technique. Determined crystal structures revealed that mutations at positions 39 and 62 did not affect the conformation of the protein main chain. Substitutions of polar amino acids at positions 39 and 62 did not change the mode of binding aliphatic ligand (myristic acid) and did not change specific interactions between protein and aliphatic ligand. The structure of the L39K complex with tetracaine showed that Lys39 changed the position of the ligand in β-barrel. The substitution of Tyr in position 39 caused the narrowing of the binding site entrance resulting in accommodation of endogenous aliphatic ligand in β-barrel. Polar residues substituted at position 39 and 62 decreased protein stability, while mutation L39Y (together with mutation M107L) stabilized the protein structure.

Celem pracy było otrzymanie i badania strukturalne nowych wariantów β-laktoglobuliny posiadających mutacje w rejonie wejścia do β-baryłki. Badano pięć różnych mutantów L39K, L39Y, E62R, E62K oraz L39Y-M107L. Ekspresję białek prowadzono w komórkach Origami B(DE3). Komórki bakteryjne rozbijano przez sonikację. Białka znajdujące się w lizacie komórkowym frakcjonowano w pierwszym etapie na kolumnie jonowymiennej a następnie oczyszczano przez sączenie molekularne. Białka oraz ich kompleksy z modelowymi ligandami (kwas mirystynowy, tetrakaina) krystalizowano techniką wiszącej kropli. Otrzymane struktury krystaliczne ujawniły, że mutacje wprowadzone w pozycjach 39 oraz 62 nie wpłynęły na konformację łańcucha głównego. Substytucje polarnych aminokwasów w pozycjach 39 i 62 nie wpłynęły na sposób wiązania do białka alifatycznych ligandów (kwas mirystynowy) oraz nie zmieniły znacząco specyficznych oddziaływań białka z takimi ligandami. Struktura kompleksu wariantu L39K z tetrakainą ujawniła, że Lys39 powoduje zmianę położenia liganda w miejscu wiążącym. Podstawienie Tyr w pozycji 39 spowodowało zwężenie okolic wejścia do miejsca wiążącego, co skutkowało zatrzymywaniem alifatycznych endogennych ligandów w β-baryłce. Polarne reszty podstawione w pozycję 39 oraz 62 powodowały obniżenie stabilności białka, natomiast mutacja L39Y (wraz z mutacją M107L) stabilizowała strukturę.