Wpływ różnicowania komórek linii ES-D3 na zmianę ekspresji białka MCPIP1

Stem cells are primary, unspecialized cells which have the ability to divide unlimitedly. The division of the stem cells enables generation of the specialized daughter cells. Due to the variety of potential applications, stem cells are extensively studied. Studies include both, basic and applied research. The goal of the basic research is to reveal the origin of the stem cells, the mechanisms of their differentiation or to describe the abilities of the stem cells to migrate. The aim of my study was to determine whether the differentiation of ES-D3 cells influences the level of MCPIP1. ES-D3 murine embryonic stem cell line derived from the mouse blastocyst was used as a model. The cells are adherent and form spherical colonies in in vitro cultures. Introduction of appropriate supplements into the media e.g. LIF (Leukemia inhibitory factor) allows maintaining ES-D3 cells in the undifferentiated state. Cell line can be genetically modified, as well as differentiated into numerous cell types, therefore it is a good experimental model.MCPIP1 is a protein having a variety of important functions. It acts as a negative regulator of the inflammatory response and as a modulator in the neurogenesis and adipogenesis. MCPIP1 was also shown to modulate the immune response by regulating the level of the specific mRNA molecules. However, in the context of the presented research, the most important function of MCPIP1 is mediating the process of cell differentiation.In this study the change of MCPIP1 expression was investigated upon withdrawal of LIF from the media, which induces the differentiation of cells. To confirm the process of differentiation the levels of mRNA for the markers of pluripotency (Nanog, Sox2, Oct4 and Klf4) were examined using real-time PCR. The expression levels of the markers were also evaluated on the protein level with Western blot. At the same time the expression of MCPIP1 was examined on both mRNA and protein level. The effect of the differentiation on the viability and metabolic activity of the cells was shown. The influence of the LIF absence on the culture growth and morphology was monitored under the microscope. The results show that the withdrawal of LIF causes a significant decrease of the expression levels of pluripotency markers in ES-D3 line, which is characteristic to the process of differentiation. The study has shown that MCPIP1 level changes during the differentiation, however the results are not sufficient to suggest the mechanism of this process. Further experiments has to be performed to better understand, whether the changes in the expression of MCPIP1 directly influence the level of pluripotency markers reflecting the differentiation potential of the cells.

Komórki macierzyste to pierwotne, niewyspecjalizowane komórki mające zdolność do nieograniczonej liczby podziałów, w trakcie których wytwarzają zróżnicowane komórki potomne. Ze względu na mnogość ich potencjalnych zastosowań zainteresowanie komórkami macierzystymi jest bardzo duże, a badania prowadzone są zarówno w zakresie podstawowym, jak i aplikacyjnym. Zakres badań podstawowych obejmuje analizę pochodzenia komórek macierzystych, mechanizmy ich różnicowania oraz badania nad ich zdolnością do migracji.Celem mojej pracy było określenie czy różnicowanie komórek linii ES-D3 wpływa na poziom MCPIP1. Jako model posłużyły mysie embrionalne komórki linii ES-D3. Są to wyizolowane z mysiej blastocysty adherentne komórki, tworzące w kulturach in vitro sferyczne kolonie. Dzięki specjalnym warunkom hodowli, tj. obecności LIF (ang. leukemia inhibitory factor) w pożywce, zdolne są one zachować swój niezróżnicowany charakter. Linia ta może być modyfikowana genetycznie, a także różnicowana w kierunku licznych typów komórek, co sprawia, że jest dobrym modelem badawczym.MCPIP1 to białko pełniące wiele ważnych funkcji w komórce. Jest negatywnym regulatorem stanu zapalnego oraz pełni rolę modulatora w procesie neurogenezy i adipogenezy. Wykazano również jego wpływ na odpowiedz immunologiczną poprzez regulację poziomu pewnych rodzajów mRNA. W kontekście przedstawionej pracy najważniejszą funkcją białka MCPIP1 jest pośredniczenie w procesie różnicowania.W poniższej pracy dokonano pomiarów poziomu ekspresji MCPIP1 po zaindukowaniu różnicowania, co następuje wskutek wycofania z pożywki LIF. W celu potwierdzenia różnicowania komórek, przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym, zbadano poziom ekspresji markerów pluripotencjalności (Nanog, Sox2, Oct4 and Klf4). Poziom ekspresji markerów został również określony na poziomie białka przy użyciu metody Western blot. Następnie, z zastosowaniem tych samych metod, zbadano poziomy białka oraz mRNA dla MCPIP1. Zbadano również wpływ różnicowania na żywotność i aktywność metaboliczną komórek. Wpływ wycofania LIF na wzrost i morfologię komórek wykazano poprzez obserwacje mikroskopowe.Wyniki wskazują, że wycofanie LIF powoduje znaczny spadek poziomu ekspresji markerów pluripotencjalności w komórkach macierzystych linii ES-D3, co jest charakterystyczne dla procesu różnicowania. W pracy wykazano, że poziom ekspresji białka MCPIP1 ulega zmianie podczas różnicowania, choć wyniki nie są wystarczające by określić mechanizm kierujący tym procesem. Aby lepiej zrozumieć czy zmiany poziomu ekspresji MCPIP1 bezpośrednio wpływają na poziom ekspresji markerów pluripotencjalności, a co za tym idzie potencjał komórek, niezbędne są dalsze badania.