Determination of acid dissociation constant (pKa) of coumarin derivatives by capillary electrophoresis.

In this work capillary electrophoresis has been used to determine acid dissociation constant of 20 structurally diverse coumarin derivatives. For a majority of the compounds pKa value has been determined for the first time. The obtained values vary between 4.16–9.10 pH unit, pointing to the interesting structure-acidity relationships. A traditional methodology relying on measurements in a broad pH range and fitting of a sigmoidal function has been compared to an alternative, simplified approach, reported for the first time, where only two electrophoretic mobility values suffice for pKa estimation. The first value corresponds to the partially ionized form and it is measured experimentally, while the second one to the totally ionized form − it is measured experimentally (two-values method, TVM) or estimated directly from molecular mass (one-value method, OVM). It has been showed that despite a limited measurements number, the alternative approach may be consistent with the traditional methodology, yielding the relatively low pKa deviation. Its utility has also been confirmed by the analytical predictions, comprising resolution, migration order, migration times and peaks overlapping. Moreover the temperature dependence of the pH buffer has been investigated, but the changes were within the error range. The limiting electrophoretic mobilities have been also calculated for investigated compounds. In addition, a CE separation simulation was performed using the PeakMaster software, which has resulted in generation of the profiles of electrophoretic separation. The optimum pH of 8.5 has provided almost complete separation of a mixture consisting of investigated derivatives. The results are important from the analytical, theoretical and pharmacological points of views.

Celem pracy było m.in. wyznaczenie wartości pKa 20 pochodnych kumaryny techniką elektroforezy kapilarnej. Dla większości związków wartości te zostały oszacowane po raz pierwszy. Uzyskane wartości zawierają się w zakresie między 4,16-9,10 jednostki pH, wskazując na interesujący związek między ich strukturą, a kwasowością. Tradycyjna metoda opierająca się na pomiarach w szerokim zakresie pH i dopasowaniu sinusoidalnej funkcji została porównana do alternatywnego, uproszczonego podejścia, gdzie tylko dwie wartości ruchliwości elektroforetycznej wystarczają do określenia wartości pKa. Pierwsza wartość odpowiada formie częściowo zjonizowanej, a druga postaci całkowicie zjonizowanej, obie są mierzone doświadczalnie (metoda dwóch wartości, TVM) lub oszacowane bezpośrednio z masy cząsteczkowej związku (metoda jednej wartości, OVM). Zauważono, że mimo ograniczonej liczby pomiarów alternatywne podejścia mogą być zgodne z tradycyjną metodą, otrzymując niewielkie rozbieżności w wyznaczonych wartościach pKa. Uzyteczność proponowanych metod została również potwierdzona przez prognozy analityczne, obejmujące rozdzielczość, kolejność migracji, czasy migracji oraz nakładanie się pików. Zbadano również stabilność temperaturową wykorzystywanych buforów pH, potwierdzając, że zmiany pH mieściły się w zakresie błędu. Dla badanych związków wyznaczono wartości granicznych ruchliwości elektroforetycznych. Dodatkowo przeprowadzono symulację rozdzielania elektroforetycznego za pomocą oprogramowania PeakMaster i wygenerowano profile elektroforetyczne separacji. W optymalnym pH, wynoszącym 8,5 uzyskano prawie całkowite rozdzielenie mieszaniny badanych pochodnych kumaryny. Otrzymane doświadczalnie wyniki są istotne z teoretycznego, praktycznego oraz farmakologicznego punktu widzenia.