Induced neural differentiation of ovarian Putative Stem Cells (PSCs): identification of selected protein markers

The work described below aims to demonstrate the ability of neural in vitro differentiation of ovarian Putative Stem Cells (PSCs). The Stemcell Technologies EasySep ™ kit was used for magnetic cell isolation. PSCs were cultured for 48 hours in DMEM/F12 with B-27 and SCF to maintain cells in undifferentiated state. Then for the next 7 days, PSCs were differentiated using forskolin and forskolin with b-FGF at concentrations: 10µM/ml and 10 ng/ml, respectively. After culture, the cells were fixed in order localization of nestin by immunofluorescence. Moreover, nestin was assessed at protein level by Western blot. Nestin is an intermediate filaments protein and serves as marker of neuronal cells.Morphology of cells in culture stimulated by differentiation factors and immunolocalization of nestin show that ovarian PSCs may differentiate into cells similar to neurons. The best result of differentiation was obtained by using forskolin and b-FGF at the same time. The confirmation of pluripotency of ovarian PCSs on the basis of neural differentiation serves as one of their many characterizations, and may provide the bridge to a wide range of therapeutic applications. Further studies of the character and transformative capabilities of PSCs are recommended.

Celem przedstawionej pracy licencjackiej jest określenie zdolności do różnicowania w kierunku neuronalnym potencjalnych komórek macierzystych jajnika (ang. Putative Stem Cells; PSCs) in vitro. Do izolacji PSCs z zawiesiny enzymatycznie trawionej kory jajnika świni zastosowano metodę magnetycznego sortowania komórek z użyciem zestawu EasySepTM firmy StemcellTM Technologies. Uzyskane PSCs sortowano względem obecności markera pluripotencji SSEA-4 na ich powierzchni. Po 48 godzinach hodowli wstępnej przeprowadzono 7-dniową hodowlę różnicującą w kierunku neuralnym. Zastosowano dwa protokoły różnicowania: część komórek zostało poddane działaniu forskoliny (10µM/ml), część komórek poddano jednoczesnemu działaniu forskoliny (10µM/ml) z dodatkiem czynnika wzrostu fibroblastów (ang. basic Fibroblast Growth Factor – b-FGF; 10 ng/ml). W 7 dniu hodowle zakończono i komórki z każdej grupy eksperymentalnej przeznaczono do analizy morfologicznej oraz analizy specyficznego markera komórek neuralnych: nestyny, na poziomie białka (Western blot, analiza immunofluorescencyjna). Otrzymane wyniki pozwalają stwierdzić, że zastosowane metody różnicowania PSCs jajnika w kierunku neuralnym wydają się potwierdzać charakter pluripotencjalny domniemanych komórek macierzystych jajnika. Zmiany w morfologii oraz obecność nestyny potwierdzona immunofluorescencyjnie w PSCs hodowanych w obecności forskoliny oraz forskoliny wraz z b-FGF stanowią początek badań nad potencjałem do różnicowania komórek macierzystych jajnika. Zróżnicowanie w przyszłości dorosłych komórek macierzystych jajnika, jakimi są PSCs, w komórki nerwowe o dwóch kluczowych funkcjach takich jak: neurony motoryczne i dopaminergiczne wydaje się być priorytetowe dla zrozumienia procesów regulujących różnicowanie, które w przyszłości może otworzyć drogę do zastosowania PSCs w medycynie regeneracyjnej.