Zastosowanie metody immuno-spin trapping do oceny stresu oksydacyjnego w toku rozwoju niewydolności serca w mysim modelu Tgαq*44

Oxidative stress is defined as a homeostasis imbalance resulting from an uncontrolled increase in ROS (Reactive Oxygen Species) concentration in the cell. Numerous studies suggest that it plays an important role in the development of cardiovascular diseases (CVDs) and heart failure. The oxidative stress level is assessed by measuring the amount of free radicals (FR) or their reaction products. FRs are highly reactive and unstable molecules which can react with all the main classes of cell components. Their presence in excessive concentrations can lead to many adverse effects. However, until recently, precise examination of their role in the pathogenesis of particular diseases was not possible, due to the unavailability of methods for FR detection in vivo. The immuno-spin trapping method uses spin trapping and antigen–antibody interactions which can be easily detected by immunochemical methods. These methods provide high detection sensitivity and specificity, even in low, physiological concentrations. The aim of this study was to evaluate the oxidative stress during cardiac failure development in Tgαq*44 mice by using the immuno-spin trapping method. This is a mouse model in which an overt heart failure phenotype develops in the age of 12-14 months. An immunohistochemistry method was used with the anti-DMPO antibody as a primary antibody. Microscope images were analyzed using a newly developed, validated automatic algorithm. Based on the data obtained, the fluorescence intensity of the anti-DMPO antibody signal in the Tgαq*44 heart samples to the control mice FVB was compared. The differences between age groups of mice (8, 10, 12, 14 and 16 months) were also investigated. It was also possible to compare signal intensity at different cross-sectional locations in the heart: papillary muscle, septum, right ventricular free wall and left ventricular free wall.The results showed development of oxidative stress in Tgαq*44 mice from the age of 12 months onwards. Its level tends to increase with age, but does not occur equally in all analyzed areas of the heart. Significant changes were found in the left ventricular free wall and the septum. These are the places surrounding the left ventricle whose hipertrophy is characteristic for the overt heart failure phenotype developing in Tgαq*44 mice.

Stres oksydacyjny jest zaburzeniem homeostazy powstałym w wyniku niekontrolowanego wzrostu stacjonarnych stężeń reaktywnych form tlenu (RFT). Liczne badania sugerują, że odgrywa on istotną rolę w rozwoju chorób układu krążenia i niewydolności serca. Poziom stresu oksydacyjnego można oceniać poprzez określenie ilości wolnych rodników lub produktów ich reakcji. Wolne rodniki są wysoce reaktywne i nietrwałe oraz mogą reagować ze wszystkimi głównymi klasami składników komórek. Ich obecność w nadmiernych stężeniach może prowadzić do wielu niekorzystnych efektów. Jednakże do niedawna dokładne zbadanie ich roli w rozwoju konkretnych chorób nie było możliwe z uwagi na brak dostępnych metod umożliwiających detekcję wolnych rodników in vivo. W niedawno opracowanej metodzie immuno – spin trapping (IST) wykorzystuje się pułapkowanie spinowe i oddziaływanie antygen–przeciwciało, które następnie można w prosty sposób oznaczyć metodami immunochemicznymi. Zapewniają one wysoką czułość i specyficzność detekcji, nawet w niskich stężeniach fizjologicznych.Celem niniejszej pracy było zastosowanie metody IST do oceny stresu oksydacyjnego u myszy Tgαq*44. Jest to model, w którym z wiekiem (12 - 14 miesiąc) rozwija się fenotyp końcowej niewydolności mięśnia sercowego. Wykorzystano technikę barwienia immunohistochemicznego, w której jako przeciwciało pierwszorzędowe zastosowano przeciwciało anty – DMPO. Wykonano zdjęcia wybarwionych preparatów histologicznych, które następnie analizowano z wykorzystaniem opracowanej metody automatycznej analizy obrazu. Na podstawie otrzymanych danych porównywano intensywność fluorescencji sygnału od przeciwciał anty-DMPO w sercach myszy Tgαq*44 w stosunku do myszy kontrolnych FVB. Zbadano także różnice występujące pomiędzy poszczególnymi grupami wiekowymi myszy (8, 10, 12, 14 i 16 miesięcy). Wykorzystanie metody mikroskopowej umożliwiło obserwację intensywności sygnału w różnych lokalizacjach poprzecznego przekroju serca: mięsień brodawkowaty, przegroda, wolna ściana prawej oraz lewej komory. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono rozwój stresu oksydacyjnego u myszy Tgαq*44 od 12. miesiąca życia. Jego poziom nasila się wraz z wiekiem, jednak nie występuje równomiernie we wszystkich obszarach serca. Zauważalne zmiany znajdują się w obszarach wolnej ściany lewej komory i przegrody, czyli miejscach otaczających lewą komorę, której przerost jest charakterystyczny dla fenotypu końcowej niewydolności mięśnia sercowego rozwijającego się u myszy Tgαq*44.