Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego TNF

Ludzki czynnik martwicy nowotworów (TNF) jako cytokina prozapalna działa na wiele typów komórek wpływając m.in. na: indukcję stanu zapalnego, stymulację fagocytozy, czy w niektórych warunkach proliferację i różnicowanie komórek. Ekspresja genu TNF zachodzi głównie w aktywowanych makrofagach oraz monocytach jak i innych komórkach. Naturalnie TNF występuje w postaci błonowej (27kDa) oraz rozpuszczalnej (17 kDa). Rozpuszczalna forma powstaje przez odcięcie ektodomeny formy błonowej m.in.: przez sekretazę ADAM17, a w przypadku jej braku przez ADAM10. Ekspresję rekombinowanego hTNF prowadzono w komórkach eukariotycznych ADAM17-/-TNF+ w związku z brakiem zanieczyszczeń LPS. Białko oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa, a stężenie wyznaczano kanapkowym testem ELISA.

Human tumor necrosis factor (TNF) as proinflammatory cytokine acts on many cell types, affecting for: inflammatory induction, phagocytosis stimulation, or cell proliferation and differentiation under certain conditions. Expression of the TNF gene occurs mainly in activated macrophages, monocytes and other cells. Naturally, TNF is present in the membrane form (27kDa) and soluble (17kDa). The soluble form is formed by cutting off the ectodomain of the membrane form, inter alia: by ADAM17 secretase, and in case it is absent by ADAM10.Expression of recombinant hTNF was performed in ADAM17 - / - TNF + eukaryotic cells due to lack of LPS impurity. Protein was purified by affinity chromatography, and concentration was determined by sandwich ELISA.