Optimization of expression, purification and crystallization of selected recombinant proteins from the group of immunological checkpoints

Zaangażowanie ligandów z rodziny B7 oraz oddziałujących z nimi receptorów z rodziny CD28 w procesy regulacji odpowiedzi immunologicznej polegające na hamowaniu funkcji efektorowych limfocytów T czyni je bardzo atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Niniejsza praca poświęcona została otrzymaniu białek rekombinowanych z grupy punktów kontrolnych układu odpornościowego: HHLA2 oraz wchodzącego z nim w interakcję receptora TMIGD2. Posłużono się prokariotycznym systemem ekspresyjnym opartym na szczepie bakteryjnym Escherichia coli Rosetta (DE3). Odpowiednia konstrukcja wektorów plazmidowych zawierających sekwencje kodujące zewnątrzkomórkowe domeny badanych białek pozwoliła uzyskać fragmenty potencjalnie odpowiedzialne za przekaz sygnału oraz wzajemne rozpoznawanie się na powierzchni komórek. Pozbawione natywnej struktury białka zlokalizowane w bakteryjnych ciałach inkluzyjnych poddano procesowi renaturacji in vitro. Pozwoliło to na optymalizację warunków umożliwiających im przywrócenie właściwej konformacji oraz odzyskanie aktywności biologicznej. Oczyszczenia biomolekuł z zanieczyszczeń dokonano posługując się techniką sączenia molekularnego, a prawidłowe fałdowanie łańcucha polipeptydowego otrzymanych białek sprawdzono wykorzystując spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). W oparciu o dostępne komercyjnie zestawy roztworów krystalizacyjnych wstępnie określono warunki sprzyjające krystalizacji badanych białek. Otrzymanie oraz późniejsza charakterystyka strukturalna omawianych cząsteczek oraz ich kompleksu pozwoli na przybliżenie aspektu ich funkcjonalności oraz poznanie roli owego oddziaływania w trakcie rozwoju choroby nowotworowej.

The involvement of B7 family ligands and CD28 family receptors in the immune response regulation processes including inhibition of effector T-cell functions makes them very attractive therapeutic targets. This dissertation presents the expression of recombinant proteins from the group of immunological checkpoints: HHLA2 and TMIGD2. A prokaryotic expression system based on the Escherichia coli Rosetta (DE3) bacterial strain was used. The construction of plasmid vectors containing sequences encoding the extracellular domains of presented biomolecules allowed to obtain fragments responsible for the signal transmission and recognition on the surface of cells. The proteins were located in bacterial inclusion bodies where they were devoid of native structure. They were refolded to provide conditions enabling restoration of proper conformation and recovery of biological activity. Obtained macromolecules were further purified using size exclusion chromatography. The properly folding of protein was evaluated by NMR measurements. The conditions for protein crystallization were determined based on the available screens. The structural characteristics of discussed molecules, both alone and in the complex, will allow the approximation of the aspect of their functionality and understanding the role of this interaction in cancer.