Impact of the intron's presence on the construct's degradation by MCPIP1

The main purpose of the following paper was to check whether the presence of the intron affects degradation of the recombinant transcript by MCPIP1 protein. MCPIP1, also called Regnase-1, is an endoribonuclease involved in the decay of translationally active mRNAs during the early stage of inflammation. Target transcripts possess characteristic stem-loop structure in their 3’UTR. The purpose of this study was to analyze the role of UPF1 helicase in this process. The first step of the experiment was to perform classical cloning involving the beta globulin intron and the pmirGLO vector with a pre cloned sequence of interleukin-6 (IL-6) 3’UTR. The experiment was carried out in two versions. In the first version intron was placed upstream of the 3’UTR sequence, in the second downstream of the 3’UTR sequence. Obtained constructs were introduced into U-251 MG cells. U-251 MG cell line is a cancer-derived malignant glioblastoma. Due to its features, i.e. high viability and a relatively short doubling time (24 hours), makes it a convenient work-tool. Detection was performed using the Dual-Luciferase Reporter Assay System which is based on the activity of products encoded by two reporter genes. Frist, the firefly’s luciferase gene (Photicus pyralis). The level of this luciferase activity is dependent on the influence of the studied factors. The other, the Renilla luciferase gene (Renilla reniformis) – is the reference value. The level of Renilla luciferase activity does not depend on the tested factors, but on the transfection efficiency. The result used for the analysis was the ratio of firefly luciferase activity values to Renilla luciferase activity. The result obtained from two research trials, including one with the addition of the MCPIP1 coding vector, made it possible to advance two hypotheses: cloning the intron upstream of the 3’UTR sequence stabilizes transcript and hinders its degradation; and cloning the intron downstream of the 3’UTR sequence does not affects mRNA degradation. These hypotheses should be verified by making a greater number of trials.

Celem poniższej pracy było sprawdzenie czy obecność intronu wpłynie na degradację rekombinowanego transkryptu przez białko MCPIP1. MCPIP1 nazywany także regnazą-1 jest endorybonukleazą zaangażowaną we wczesnej fazie zapalenia w rozkład translacyjnie aktywnych mRNA indukowanych przez cytokiny. MCPIP1 bierze udział w degradacji transkryptów posiadających charakterystyczną strukturę typu spinka do włosów w rejonie 3’UTR. Celem pracy było sprawdzenie roli helikazy UPF1 w tym procesie. Pierwszym etapem eksperymentu było przeprowadzenie klasycznego klonowania z wykorzystaniem intronu beta globuliny oraz wektora pmirGLO z uprzednio wklonowaną sekwencją 3’UTR interleukiny-6 (IL-6). Doświadczenie wykonano w dwóch wersjach. W pierwszej intron umieszczono powyżej sekwencji 3’UTR; w drugiej – poniżej sekwencji 3’UTR. Uzyskane konstrukty wprowadzono do komórek U-251 MG. Jest to nowotworowa linia komórkowa pochodząca ze złośliwego glejaka wielopostaciowego. Ze względu na swoje cechy, tj. duża żywotność oraz stosunkowo krótki czas podwojenia (24 godziny) stanowi wygodne narzędzie do pracy. Detekcji dokonywano wykorzystując system Dual-Luciferase Reporter oparty o aktywność produktów kodowanych przez dwa geny reporterowe. Pierwszy, gen lucyferazy ze świetlika (firefly, Photicus pyralis), koduje białko, którego ilość jest zależna od wpływu badanych czynników. Drugi, gen lucyferazy Renilla (Renilla reniformis) – stanowi wartość referencyjną. Poziom aktywności lucyferazy Renilla nie zależy od badanych czynników, lecz od wydajności transfekcji. Wynikiem wykorzystywanym do analizy było stosunek wartości aktywność lucyferazy firefly do aktywności lucyferazy Renilla. Wyniki uzyskane z dwóch prób badawczych, w tym jednej z dodatkiem wektora kodującego MCPIP1 umożliwiły postawienie dwóch hipotez: wklonowanie intronu powyżej sekwencji 3’UTR stabilizuje rekombinowany transkrypt i utrudnia jego degradację oraz intron poniżej sekwencji 3’UTR nie wpływa na degradację transkryptu. Hipotezy te powinny zostać zweryfikowane poprzez dokonanie większej liczby prób badawczych.