Wprowadzanie DNA do komórek eukariotycznych niesie olbrzymi potencjał do wykorzystania w wielu dziedzinach. Obecnie najbardziej wydajną metodą transferu kwasów nukleinowych jest zastosowanie wektorów wirusowych, jednak mogą być one niebezpieczne w zastosowaniu klinicznym. Obiecującą alternatywą jest lipofekcja - metoda chemiczna oparta na zastosowaniu lipidów kationowych spontanicznie tworzących kompleksy (lipopleksy) z ujemnie naładowanymi kwasami nukleinowymi. Lipofekcja jest złożonym i stosunkowo słabo poznanym procesem. Jednym z najważniejszych etapów lipofekcji, który może limitować jej wydajność, jest internalizacja lipopleksów. Dlatego identyfikacja dróg pobierania lipopleksów jest bardzo ważna w badaniu mechanizmu lipofekcji. Przykładem obiecujących lipofektantów, których drogi pobierania nie zostały dotychczas zbadane są jodki trimetylopoliprenyloamoniowe (PTAI) syntetyzowe z alkoholi poliprenylowych izolowanych z tkanek roślinnych. Celem niniejszej pracy była identyfikacja dróg pobierania lipopleksów opartych na PTAI przez komórki linii DU145 (ludzkiego raka prostaty), B16F10 (mysiego czerniaka), XC (szczurzego mięsaka) w różnych warunkach (obecność surowicy, skład lipopleksów). Wybrane linie komórkowe charakteryzowały się różną podatnością na transfekcję odczynnikami PTAI. W eksperymentach zastosowano mieszaniny lipofekcyjne złożone z PTAI-7 (jodek trimetyloheptaprenyloamoniowy) + DOPE (1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloamina) oraz PTAI-11 (jodek trimetyloundekaprenyloamoniowy) + DOPE + DC cholesterol (chlorowodorek {3ß-[N-(N’,N'-dimetyloaminoetan)-karbamoilo] cholesterolu}). Wprowadzano plazmidowe DNA zawierające gen reporterowy kodujący białko wzmocnionej zielonej fluorescencji EGFP i badano wpływ inhibitorów endocytozy na efektywność lipofekcji. Użyto inhibitorów blokujących mechanizmy pobierania (filipina, chlorowodorek chlorpromazyny, dimetyloamiloryd, wortmanina) i transportu (cytochalazyna D, nokodazol). Na podstawie otrzymanych wyników można stwierdzić, że pobieranie badanych lipopleksów zachodzi na drodze endocytozy klatrynowej, kaweolarnej i makropinocytozy. Udział poszczególnych dróg endocytozy jest zależny od składu lipopleksów, typu komórek i obecności surowicy. Lipopleksy oparte na PTAI-7 są pobierane na drodze endocytozy klatrynowej (komórki DU145) lub klatrynowej i makropinocytarnej (B16F10 i XC). Lipopleksy oparte na PTAI-11 są pobierane w warunkach bezsurowiczych na drodze endocytozy klatrynowej (DU145) lub klatrynowej, kaweolarnej i makropinocytozy (B16F10 i XC). Obecność surowicy nie miała wpływu na drogi pobierania lipopleksów w komórkach DU145, ale miała wpływ na aktywność makropinocytarną komórek XC. W warunkach surowiczych nie wykryto dominujących dróg pobierania lipopleksów do komórek B16F10. Depolimeryzacja cytoszkieletu aktynowego lub mikrotubularnego miała pozytywny wpływ na przebieg wydajnej transfekcji badanymi lipopleksami. Podsumowując, drogami pobierania lipopleksów opartych na PTAI są endocytoza klatrynowa, kaweolarna i makropinocytoza w zależności od typu komórek, składu lipopleksów i obecności surowicy. Wyniki wnoszą wiele cennych informacji na temat mechanizmu internalizacji lipopleksów opartych na PTAI. Mogą one przyczynić się do udoskonalenia mieszanin lipofekcyjnych, co potencjalnie umożliwi zastosowanie odczynników PTAI w wielu dziedzinach.
The ability to introduce DNA into eukaryotic cells can bring a great potential for use in many areas. Currently, the most efficient method of nucleic acid delivery is utilization of viral vectors, however this method can be dangerous in clinical use. A promising alternative is lipofection – a chemical method based on the use of cationic lipids, which spontaneously form complexes (lipoplexes) with negatively charged nucleic acids. Lipofection is a complex and relatively poorly understood process. One of the most important stages of lipofection, which may limit its efficiency, is the internalization of lipoplexes. Therefore, the identification of lipoplexes uptake pathways is very important in the examination of lipofection mechanism. Trimethylpolyprenylammonium iodides (PTAI) synthesized from polyprenyl alcohols, isolated from plant tissues, is an example of promising lipofectants, which uptake pathways have not yet been tested.The aim of this study was to identify pathways of PTAI-based lipoplexes uptake in DU145 (human prostate cancer), B16F10 (mouse melanoma), XC (rat sarcoma) cells under different conditions (presence of serum, lipoplex composition). The selected cell lines were characterized by various susceptibility to PTAI-based lipofection. Lipofecting mixtures composed of PTAI-7 (trimethylheptaprenylammonium iodide) + DOPE (1,2-dioleyl-sn-glicero-3-phosphatidylethanolamine) and PTAI-11 (trimethylundecaprenylammonium iodide) + DOPE + DC cholesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride) were used to deliver plasmid DNA encoding the enhanced green fluorescence protein EGFP as a reporter of transfection efficiency into the cells. The effects of endocytosis inhibitors blocking mechanisms of uptake (filipin, chlorpromazine hydrochloride, dimethyl amiloride, wortmannin) and transport (cytochalasin D, nocodazole) on the lipofection effectiveness were studied. The results show that the uptake pathways of tested lipoplexes are clathrin-mediated endocytosis, micropinocytosis, and caveolar-mediated endocytosis. Involvement of individual endocytosis pathways depends on lipoplex composition, cell type and presence of serum. Lipoplexes based on PTAI-7 are internalized by clathrin-mediated endocytosis (DU145 cells) or clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis (B16F10 and XC). PTAI-11-based lipoplexes in serum-free conditions are taken up by clathrin-mediated endocytosis (DU145) or clathrin-mediated, caveolar-mediated endocytosis, and macropinocytosis (B16F10 and XC). Presence of serum did not affect lipoplex uptake pathways in DU145 cells but affected macropinocytic activity of XC cells. Under serum conditions main lipoplex uptake pathways in B16F10 cells were not identified. Depolymerization of actin or microtubular cytoskeleton had a positive effect on transfection effectiveness with tested lipoplexes. In conclusion, uptake pathways of PTAI-based lipoplexes are clathrin- and caveolae-mediated endocytosis and micropinocytosis depending on the cell type, lipoplex composition and presence of serum. The results bring valuable information on the uptake of PTAI-based lipoplexes into cells and can contribute to the improvement of lipofecting mixtures, potentially allowing the use of PTAI reagents in many areas.
