Produkcja mysiego białka PXT1 w oparciu o wektor ekspresyjny i hodowle transfekowanych linii komórkowych

Niepłodność to powszechny problem, za który w połowie przypadków odpowiada czynnik męski. Badanie procesu spermatogenezy i poznanie mechanizmów kontrolujących prawidłowe dojrzewanie męskich komórek płciowych wydaje się kluczowe dla poznania szerszej etiologii niepłodności. Jednym ze stosunkowo niedawno odkrytych genów, biorących udział w procesie spermatogenezy, jest gen Pxt1. Zbadano, że zarówno wariant mysi, jak i ludzki homolog (gen PXT1), kodują 51-aminokwasowe białko o właściwościach proapoptotycznych. Nadekspresja genu Pxt1 powoduje apoptozę spermatocytów I rzędu, co w konsekwencji prowadzi do samczej niepłodności. Nie udało się jak dotąd potwierdzić endogennej obecności białka PXT1 w jądrach myszy, co wiązało się z brakiem przeciwciał prawidłowo rozpoznających to białko. W ramach niniejszej pracy, która stanowi kontynuację badań przeprowadzonych do pracy licencjackiej, starano się wyprodukować fuzyjne białko HisTag-PXT1 poprzez transfekcję mysich preosteoblastów linii MC3T3-E1 subklon 4. Zidentyfikowano również linię komórek MC3T3-E1 subklon 4 jako odpowiedni model do badania apoptozy indukowanej białkiem PXT1. Opisano dokładnie wszystkie wykorzystywane metody, począwszy od uzyskania oczyszczonego plazmidowego DNA zrekombinowanego wektora ekspresyjnego pEF1/His B + ORF Pxt1, klonowanego z wykorzystaniem bakterii Escherichia coli, przez hodowlę komórkową, transfekcję z wykorzystaniem liposomów kationowych, immunocytochemię z detekcją immunofluorescencyjną, aż po analizę białek metodą Western blot. Potwierdzono produkcję białka HisTag-PXT1 przez transfekowane wektorem komórki poprzez detekcję immunofluorescencyjną, ale również przedyskutowano pomysły mogące w przyszłości posłużyć lepszej optymalizacji transfekcji oraz analizy Western blot. Otrzymane białko stanowić będzie kontrolę pozytywną podczas przyszłego testowania przeciwciał przeciwko białku PXT1, co ułatwi poznanie jego dokładnej funkcji oraz roli w procesie spermatogenezy.

Infertility is a common problem for which half of the cases are caused by the male factor. Studying the process of spermatogenesis and understanding the mechanisms that controls a proper maturation of male germ cells seems to be crucial for understanding the wider etiology of infertility. One of the relatively recently discovered genes involved in the process of spermatogenesis is the Pxt1 gene. Both mouse variant and human homolog (PXT1 gene) were tested to encode a 51 amino acid protein with proapoptotic properties. Overexpression of the Pxt1 gene leads to apoptosis of primary spermatocytes, which leads to male infertility. The endogenous presence of the PXT1 protein in mice testes has not been confirmed, which was associated with the lack of antibodies correctly recognizing this protein.In this work, which is a continuation of the research done for bachelor thesis, an attempt to produce the HisTag-PXT1 fusion protein by transfection of mice preosteoblasts cell line MC3T3-E1 subclone 4 was made. The MC3T3-E1 subclone 4 cell line was also identified as a suitable model to study PXT1-induced apoptosis. All the methods used are described in detail, from obtaining purified plasmid DNA as the recombinant expression vector pEF1/His B + ORF Pxt1, cloned inside of Escherichia coli bacteria, through cell culture, transfection using cationic liposomes, immunocytochemistry with immunofluorescence detection, to protein analysis with Western blot method. The production of the HisTag-PXT1 protein by the vector-transfected cells was confirmed with immunofluorescence detection, but also a few ideas that could be used in the future for better optimization of transfection and Western blot analysis were discussed. The obtained protein will become a positive control during future testing of antibodies against the PXT1 protein, which will help to examine its exact functions and a role in the spermatogenesis process.