Obtaining and characterizing diagnostic monoclonal antibodies for the detection of pathogenic bacteria in farm animals

Mastitis in dairy cows is a disease of great economic importance, contributing to enormous financial losses in the dairy industry. One of the factors responsible for the development of this disease are pathogens such as Streptococcus agalactiae. These bacteria are contagious, so it is important to diagnose infections quickly. Immunochromatographic lateral flow strip tests can be used for quick and qualitative determination of the presence of an analyte because they use specific monoclonal antibodies. The aim of my work was to generate a hybridoma cell line that produces monoclonal antibodies which can recognize the Sip protein on the surface of S. agalactiae. First, two hybridoma cell lines, 3.10D3 and 4.10F5, which synthesized IgG1 (κ) monoclonal antibodies recognizing the recombinant Sip protein used for immunization, were obtained by using the cell fusion technique of myeloma cells with splenocytes of immunized mice. In the course of cultivation, line 4.10F5 was found to have better antibody production efficiency, while line 3.10D3 was a very poor producer of antibodies. An attempt was made to produce antibodies in CelLine laboratory bioreactors in order to obtain high concentrations of monoclonal antibodies. Antibodies produced by each hybridoma cell line were purified by affinity chromatography on a CaptureSelectTM LC-kappa (mur) Affinity Matrix. Finally, 0.168 mg of 3.10D3 antibodies and 2.2 mg of 4.10F5 antibodies were obtained. To test the ability of the antibodies to recognize the native Sip antigen on the surface of S. agalactiae, an ELISA test on bacterial cells was developed. The results showed that the antibodies can be used to develop diagnostic tests detecting the infection with these bacteria.

Zapalenie wymion u krów mlecznych jest chorobą o dużym znaczeniu ekonomicznym, przyczyniającą się do ogromnych strat finansowych w przemyśle mleczarskim. Jednym z czynników, odpowiedzialnych powstawanie tej choroby są patogeny takie jak Streptococcus agalactiae. Ze względu na to, że bakterie S. agalactiae są patogenami zaraźliwymi, ważna jest szybka diagnostyka zakażeń. Immunochromatograficzne paskowe testy o przepływie bocznym umożliwiają szybkie jakościowe oznaczenie obecności analitu, dzięki zastosowaniu specyficznych względem niego przeciwciał monoklonalnych. Celem mojej pracy magisterskiej było wygenerowanie linii komórek hybrydoma, produkujących przeciwciała monoklonalne rozpoznające białko Sip znajdujące się na powierzchni bakterii S. agalactiae. Na początku, za pomocą techniki fuzji komórkowej komórek szpiczaka ze splenocytami immunizowanych myszy, udało się uzyskać dwie linie komórek hybrydoma – 3.10D3 i 4.10F5, które syntezowały przeciwciała monoklonalne IgG1 (κ) rozpoznające rekombinowane białko Sip użyte do immunizacji. W trakcie hodowli okazało się, że linia 4.10F5 charakteryzowała się lepszą wydajnością w produkcji przeciwciał, natomiast linia 3.10D3 była bardzo słabym producentem przeciwciał. Podczas hodowli podjęto próbę produkcji przeciwciał w bioreaktorach laboratoryjnych CelLine w celu uzyskania dużego stężenia przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała wyprodukowane przez każdą z linii oczyszczano za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu CaptureSelectTM LC-kappa (mur) Affinity Matrix. Ostatecznie otrzymano 0,168 mg przeciwciał 3.10D3 i 2,2 mg przeciwciał 4.10F5. Aby sprawdzić zdolność przeciwciał do rozpoznawania natywnego antygenu Sip znajdującego się na powierzchni S. agalactiae opracowano test ELISA na komórkach bakteryjnych. Uzyskane w teście wyniki wykazały, że otrzymane przeciwciała mogą posłużyć do opracowania testów diagnostycznych wykrywających zakażenie tymi bakteriami.