"SNAP" - Uniwersalny system wewnątrzkomórkowego dostarczania ładunku oparty na podjednostce B toksyny Shiga.

Toksyna Shiga jest egzotoksyną bakteryjną o konfiguracji molekularnej AB5. Aktywna enzymatycznie monomeryczna podjednostka A (Shiga toxin subunit A; StxA) jest niekowalencyjnie związana z homopentamerem składającym się z pięciu identycznych fragmentów B, które tworzą podjednostkę B (Shiga toxin subunit B; StxB). Podjednostka B odpowiada za oddziaływanie z receptorami na powierzchni komórki i internalizację toksyny. Wiązanie StxB jest możliwe dzięki interakcji ze specyficznym receptorem, jakim jest neutralny glikosfingolipid globotriaosylceramid (Gb3) obecny na powierzchni komórek [1]. Stwierdzono, że Gb3 ulega ograniczonej ekspresji w komórkach nabłonkowych i nadekspresji w różnych pierwotnych nowotworach ludzkich i nowotworowych liniach komórkowych [2]. Warto zauważyć, że przy braku enzymatycznie aktywnego StxA, StxB nadal przyjmuje swoją pentameryczną strukturę i zdolność do wiązania się z receptorem [3], co czyni go potencjalnym kandydatem do zaprojektowania systemu wewnątrzkomórkowego dostarczania ładunku. Celem niniejszej pracy było opracowanie uniwersalnego, opartego na StxB systemu dostarczania wewnątrzkomórkowego o nazwie "SNAP" z wykorzystaniem zmodyfikowanej StxB i metody koniugacji chemicznej wymagającej zastosowania łącznika maleimid-polietylenoglikol-(2)-succinimidyl ester (Mal-PEG2-NHS). Jako przykładowe białka ładunkowe wykorzystano białka fluorescencyjne EGFP i mCherry. Wynajność tworzenia koniugatów StxB oceniono na podstawie elektroforezy SDS-PAGE i sączenia molekularnego, a następnie badań internalizacji z wykorzystaniem linii komórkowej VeroE6 i obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Metoda "SNAP" opracowana w tych badaniach może być wdrożona jako technika dostarczania ładunku wewnątrzkomórkowego z udziałem StxB oraz jako latwa i wydajna metoda do tworzenia kompleksów białkowych.

Shiga toxin is a bacterial exotoxin possessing an AB5 molecular configuration. An enzymatically active monomeric A subunit (Shiga toxin subunit A; StxA) is non-covalently associated with a homopentamer consisting of five identical B fragments that form the subunit B (Shiga toxin subunit B; StxB). B subunit is responsible for binding to the cell surface receptors and the toxin internalisation. StxB binding is possible through the interaction with the specific receptor the neutral glycosphingolipid globotriaosylceramide (Gb3) present on the surface of cells [1]. Gb3 was found to be restrictedly expressed in epithelial cells and overexpressed in various primary human cancers and cancer cell lines [2]. Notably, in the absence of the enzymatically active StxA, StxB still adopts its pentameric structure and the ability for receptor binding [3], which makes it a potential candidate for designing the intracellular delivery system. This work aimed to develop a versatile StxB-based intracellular delivery system called "SNAP" using a modified StxB and a chemical conjugation method requiring a maleimide-polyethylene glycol-(2)-succinimidyl ester (Mal-PEG2-NHS) linker. EGFP and mCherry fluorescence proteins were used as example cargo proteins. The success of the StxB conjugates formation was assessed by SDS-PAGE electrophoresis and size-exclusion chromatography, followed by the internalisation studies using the VeroE6 cell line and confocal microscopy imaging. "SNAP" method developed in these studies could be implemented as an StxB-mediated intracellular cargo delivery technique and could overturn the protein-protein conjugation in general.