Molecular characterization of pathogenic pseudouridine synthase 3 (PUS3) variants

Transferowy RNA (tRNA), kluczowy składnik translacji, wymaga wielu potranskrypcyjnych modyfikacji by prawidłowo pełnić swoją funkcję. Pseudourydylacja jest najczęstszą modyfikacją RNA, a wszystkie tRNA posiadają liczne miejsca pseudourydylacji. Syntazy pseudourydynowe (PUS) są odpowiedzialne za tę modyfikację, zaś PUS3 specyficznie katalizuje reakcję w pozycjach U38 i U39 . Ostatnio kilka badań powiązało mutacje genu PUS3 z zaburzeniami intelektualnymi, jednakże mechanizm tego, jak mutacje wpływają na aktywność enzymu, nie został jeszcze zbadany. W pracy zaprojektowałem dwa uzupełniające się podejścia, aby zrozumieć wpływ mutacji na funkcję białka. Po pierwsze, uzyskałem białka PUS3, w tym białko typu dzikiego i 8 wariantów z różnymi mutacjami przy użyciu owadziego systemu ekspresji. Badania biochemiczne, przy użyciu termoforezy mikroskalowej, testów enzymatycznych, nanoDSF oraz DLS, ujawniły, że niektóre mutacje wpływają na wiązanie tRNA, aktywność pseudourdylacji lub stabilność białka. Po drugie, zastosowałem system transpozycji Sleeping Beauty do wygenerowania stabilnych linii komórkowych z ekspresją tych wariantów PUS3. Następnie zmierzyłem poziomy białek za pomocą metody Western Blot i poziomy kodujących je transkryptów metodą qPCR. Mutanty, które wykazywały zmniejszoną termostabilność wykazują zmniejszony poziom białka w komórkach. Podsumowując, moje wyniki prezentują kompleksową analizę patogennych wariantów PUS3 i wyjaśniają nieprawidłowe działanie białka w chorobie.

Transfer RNA (tRNA), a key component in translation, requires multiple posttranscriptional modifications for its proper function. Pseudouridine is the most common RNA modification, and all tRNAs have numerous pseudouridine sites. Pseudouridine synthases (PUS) are responsible for pseudourydilation and PUS3 specifically catalyses the reaction at positions U38 and U39 of tRNAs. Recently, several studies have connected PUS3 mutations to intellectual disorders but the underlying mechanism of how the mutations affect enzyme activity still needs to be investigated.In this study, I designed two complementary approaches to understand the impacts of patient-derived mutations on protein function. First, I produced and purified PUS3 proteins, including wild-type and 8 variants using an insect cell expression system. A plethora of biochemical analyses, including microscale thermophoresis, enzymatic activity assays, nanoDSF and DLS, revealed that the mutations affect tRNA binding, pseudouridylation activity or protein stability. Second, I employed the Sleeping Beauty transposition system to generate stable human cell lines expressing these PUS3 variants. I measured the protein expression levels using Western Blot, as transcripts level using qPCR. In fact, those mutants, which exhibited decreased thermostability show reduced protein expression in human cells. Overall, these results present a comprehensive analysis of pathogenic PUS3 variants and explain the protein malfunction in the related disease.