Optymalizacja platformy do przyżyciowego obserwowania granul stresowych za pomocą rekombinowanego białka eIF3b

Organelle bezbłonowe (ang. membraneless organelles, MLO) to odrębne przedziały komórkowe, które nie są otoczone dwuwarstwą lipidową. Te przedziały są zaangażowane w szeroki zakres aktywności komórkowych i były opisywane jako ciałka, granule lub organelle kropelkowe. MLO stanowią sporą grupę kompartmentów wewnątrzkomórkowych formowanych na różnych etapach życia komórki. Przykładami takich organelli są granule stresowe, jąderka, ciałka Cajala, cętki jądrowe czy ciałka P. Granule stresowe (GS) to dynamiczne, cytoplazmatyczne kompleksy RNA-białko, które zawierają białka wiążące RNA, mRNA i czynniki inicjujące translację. GS powstają w odpowiedzi na zablokowaną inicjację translacji. Uważa się, że GS sekwestrują mRNA podczas stresu, aby zachować transkryptom, umożliwiając wznowienie translacji po ustaniu warunków stresowych.Do wizualizacji granul stresowych w czasie rzeczywistym wykorzystano system transpozonowy Sleeping Beauty oraz plazmid zawierający gen kodujący eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 3 podjednostka b (eIF3b) z dołączonym białkiem fluorescencyjnym w jednym z trzech wariantów kolorystycznych. System Sleeping Beauty jest niewirusowym narzędziem transferu DNA zdolnym do skutecznego pośredniczenia w opartej na transpozycji, stabilnej integracji wybranych sekwencji DNA z genomami eukariotycznymi. W niniejszej pracy docelowym DNA był gen kodujący rekombinowane białko eIF3b, które wykorzystano jako marker granul stresowych. Tworzenie granul stresowych indukowano, w transfekowanych komórkach HeLa, metaarseninem sodu – modelowym induktorem granul stresowych. Oprócz przyżyciowego obserwowania granul stresowych pod mikroskopem fluorescencyjnym analizowano również preparaty mikroskopowe. W obu przypadkach badano powstawanie granul stresowych w pojedynczej komórce w zależności od stężenia induktora.

Membraneless organelles (MLO) are distinct cellular compartments that are not surrounded by a lipid bilayer. These compartments are involved in a wide range of cellular activities and have been described as bodies, granules or droplet organelles. MLOs are a large group of intracellular compartments formed at various stages of the cell's life. Examples of such organelles are stress granules, nucleolus, Cajal bodies, nuclear speckles and P bodies.Stress granules (SG) are dynamic cytoplasmic RNA-protein complexes that contain RNA-binding proteins, mRNA and translation initiation factors. SGs arise in response to blocked translation initiation. SGs are thought to sequester mRNA during stress to preserve the transcriptome, allowing translation to resume once the stress conditions are over.The Sleeping Beauty transposon system and constructed plasmid were used to visualize stress granules in real time, containing a gene encoding eukaryotic translation initiation factor 3 subunit b (eIF3b) with an attached fluorescent protein in one of three color variants. The Sleeping Beauty system is a non-viral DNA transfer tool capable of effectively mediating transposition-based, stable integration of selected DNA sequences into eukaryotic genomes. Here, the targeted DNA was the gene encoding the recombinant eIF3b protein, which was used as a stress granule marker. The formation of stress granules was induced in transfected HeLa cells by sodium metaarsenite, a model stress granule inducer. In addition to the intravital observation of stress granules under a fluorescence microscope, microscopic preparations were also analyzed. In both cases, the influence of the concentration of the inducer on stress granules formation in a single cell was studied.