Cloning of the DNA fragments reflecting the open reading frame I and II of the I-18 C gene of Chironomus tentans. VII. The preparation of the inserts and the translational vector - pET-3a for ligation

The technology applied for the cloning of the open reading frame (ORF) I and II reflecting DNA fragments in regard to the preparation of the inserts and the translational vector pET-3a for ligation, is described. The main steps of the preparation of the inserts include: digestion of the isolated recombinant bluescript plasmids, carrying the inserts, with the Nde I and Bam HI, purification and isolation of the inserts after the digestion, by the preparative agarose gel electrophoresis (2% gel, 1 x TAE buffer) and then by the centrifugation through the filtration device of the isolated DNA fragment from the gel and also estimation of the inserts concentration by the agarose gel electrophoresis (2% gel, 1 x TBE buffer). The main steps of the preparation of the pET-3a vector included: transformation of the competent E. coli cells of the XL-1 strain with the pET-3a, growing of the transformed bacteria on agar plates (with ampicillin) and then growing of the isolated transformed bacterial colonies in culture to finally isolate the plasmid, digestion of the plasmid with the Nde I and Bam HI, purification of the isolatcd plasmid, after the digestion, by the preparative agarose gel electrophoresis (0.8% gel, 1 x TAE buffer), centrifugation through the filtration device of the isolated DNA fragment from the gel, phenol extraction of the isolated plasmid, estimation of the concentration of the plasmid by the agarose gel electrophoresis (0.8% gel, 1 x TBE buffer).

Opisano technologię zastosowaną do klonowania fragmentów DNA odzwierciedlających otwartą ramę odczytu I i II w zakresie przygotowania wstawek i wektora translacyjnego - pET-3a do ligacji. Główne etapy przygotowania wstawek obejmowały: - trawienie Nde I i Bam HI, wyizolowanych rekombinacyjnych plazmidów blueskrypt, które zawierały wstawki, - oczyszczanie i izolację wstawek, po trawieniu przy użyciu preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym (2% żel, 1 x stężony bufor TAE) i następnie przez odwirowanie wyizolowanego fragmentu DNA z żelu, przy użyciu urządzenia filtracyjnego - oraz ocenę stężenia wstawek przy użyciu elektroforezy (2% żel, 1 x stężony bufor TBE). Główne etapy przygotowania wektora pET-3a obejmowały: transformację komórek kompetentnych E. coli szczepu XL-1, wektorem pET-3a, hodowlę stransformowanych komórek bakteryjnych na płytkach agarowych (z ampicyliną) i następnie hodowlę w kulturze wyizolowanych stransformowanych komórek bakteryjnych w celu izolacji plazmidu, trawienie wyizolowanego plazmidu Nde I i Bam HI oraz jego oczyszczenie po trawieniu, przy użyciu preparatywnej elektroforezy w żelu agarozowym (0.8% żel, 1 x stężony bufor TAE), odwirowanie wyodrębnionego z żelu fragmentu DNA przy zastosowaniu urządzenia filtracyjnego, ekstrakcję fenolową wyizolowanego plazmidu, ocenę stężenia plazmidu przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym (0.8% żel, 1 x stężony TBE).