Cloning of the DNA fragments reflecting the open reading frame I and II of the I-18 C gene of Chironomus tentans. VIII. The ligations of the inserts with the pET-3a vector and the identification of the bacterial colonies, containing the recombinant plasmids

The technology used for the cloning of the open reading frame (ORF) I and II reflecting DNA fragments in regard to the ligations of the inserts with the pET-3a vector and the identification of the bacterial colonies, containing the recombinant plasmids, is presented. The main steps include: calculation of the molar ratios of the vector to insert DNA, the ligation reactions, transformation of the competent E. coli cells of the XL-1 strain, isolation of the plasmids, digestion of the plasmid preparations with the Nde I and Bam HI to indicate the presence of the inserts cloned into the plasmids, using the agarose gel electrophoresis (2% gel, 1 x TBE buffer) of the plasmids samples, with the released inserts, after the digestion, transformation of the competent BL21 (DE3) cells of E. coli with the isolated recombinant plasmids, identification of the bacterial cells, carrying the pET-3a plasmids with the cloned inserts and the storage of these cells.

Przedstawiono technologię użytą do klonowania fragmentów DNA odzwierciedlających otwartą ramę odczytu I i II genu I-18 C Chironomus tentans w zakresie ligacji wstawek z wektorem pET-3a oraz identyfikacji kolonii bakteryjnych, zawierających rekombinacyjne plazmidy. Główne etapy obejmują: obliczenie stosunków molarnych wektora do DNA wstawki, reakcje ligacji, transformację komórek kompetentnych E. coli szczepu XL-1, izolację plazmidów, trawienie preparatów plazmidów Nde I i Bam Hl w celu wskazania obecności wklonowanych do plazmidów wstawek, uwolnionych z tych plazmidów poprzez trawienie wymienionymi enzymami restrykcyjnymi. Analizę produktów trawienia poszczególnych próbek plazmidów wykonano przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym (2% żel, 1 x stężony bufor TBE). Następne etapy to transformacja komórek kompetentnych E. coli BL21(DE3) preparatami wyizolowanych zrekombinowanych plazmidów pET-3a i identyfikacja komórek bakteryjnych, zawierających plazmidy pET-3a z wklonowanymi wstawkami oraz przechowywanie tych komórek.