Determination of hippuric acid by RP-HPLC using two different analytical columns - a short report

Reversed-phase HPLC of liberated hippuric acid (HA) from an ACE assay in the presence of ACE inhibitory peptides derived from a crackling hydrolysate was conducted. The efficacies of two different analytical HPLC columns using identical mobile phases with an isocratic system were tested. Chromatograms revealed that the shorter C8 column (4.6 × 150 mm, 5 μm) was just as efficient as the longer C18 column (4.6 × 250 mm, 5 μm) in resolving liberated HA, but achieved this in a much shorter time (i.e., 3.67 cf 12.52 min). The presence of the crackling hydrolysate exhibited ACE-inhibiting activity by retarding the liberation of HA from the substrate hippuryl-L-histydyl-L-leucine (HHL) in a dose-dependent manner, and did not interfere with the chromatography. Hence, a quick reliable analytical methodology is at hand for the in vitro examination of various “bioactive peptide concoctions” for possible use in the development of functional foods.

W pracy oznaczano kwas hipurowy (HA) metodą HPLC w układzie odwróconych faz. Posłużono się metodą stosowaną przy pomiarze aktywności peptydowych inhibitorów ACE, których źródłem w tym przypadku był hydrolizat białek skwarek wieprzowych. Do dwóch kolumn analitycznych zastosowano identyczną fazę ruchomą w układzie izokratycznym. Skuteczność rozdziału kwasu hipurowego przy użyciu krótszej kolumny C8 (4,6 × 150 mm, 5 μm) była podobna do tej, którą otrzymano stosując dłuższą kolumnę C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm). Czas retencji dla HA w przypadku kolumny C8 był krótszy (3,67 min) niż przy zastosowaniu kolumny C18 (12,52 min). Użyty w badaniach hydrolizat wykazywał aktywność hamowania ACE poprzez hamowanie uwalniania HA z substratu HHL (hipurylo-L-histydylo-L-leucyna). Zawarte w hydrolizacie peptydy nie interferowały z HA. Zaprezentowana w pracy szybka metoda chromatograficzna może być stosowana w analizie in vitro biologicznie aktywnych peptydów w badaniach z obszaru żywności funkcjonalnej.