Comparison of ELISA and RT-PCR assays for detection and identification of cucumber mosaic virus [CMV] isolates infecting horticultural crops in Poland

The suitability of DAS-ELISA and RT-PCR methods for detection of 15 cucum¬ber mosaic virus (CMV) isolates found in Poland was compared. The effectiveness of DAS-ELISA depended on polyclonal antibodies (PAb) used in the assay. Antibodies Wic and DTL detected all tested isolates, whereas antibodies M could not detect iso¬late P26, antibodies ToRS did not react with isolate Porz, and isolate Simp2 was not detected by antibodies Cas. The RT-PCR technique allowed detection of all virus isolates. Three nucleic acid extraction methods: immunocapture (IC), silicacapture (SC) and isolation of the total RNA with the commercial kit (RN), proved to be effec-tive. These three nucleic acid extraction methods all allowed CMV amplification by RT-PCR. Three methods were used to identify and group the CMV isolates: 1) ELISA with group-specific monoclonal antibodies (MAbs), 2) phylogenetic analy¬sis of coat protein gene sequence and 3) restriction analysis of PCR-amplified RNA2 and RNA3 fragments digested with EcoRI, HpaII and MluI enzymes. MAbs used in ELISA allowed the preliminary classification of isolates to group I or II, but they failed to recognize one isolate (P26). CMV grouping based on CP sequence analysis enabled us to identify all of the tested isolates and discriminate between the two groups of CMV - IA and II. Classification based on RT-PCR-RFLP analysis corre¬lated with phylogenetic grouping based on sequencing.

Porównano przydatność metody DAS-ELISA i RT-PCR do wykrywania 15 izola- tów wirusa mozaiki ogórka (CMV). Efektywność wykrywania wirusa metodą ELISA zale żała od rodzaju przeciwciał użytych do testu: przeciwciała Wic i DTL umożliwiły wykrycie wszystkich badanych izolatów, podczas gdy przeciwciała M nie reagowały z izolatem P26, przeciwciała ToRS nie wykrywały izolatu Porz, natomiast przeciw­ciała Cas nie reagowafy z izolatem Simp2. Wszystkie badane izolaty wirusa wykry­wano za pomocą metody RT-PCR. Porównano trzy metody przygotowania matryc do amplifikacji kwasów nukleinowych: wychwytywanie cząstek wirusa z użyciem prze­ciwciał (immunocapture, IC), adsorpcję kwasów nukleinowych na żelu krzemionko­wym (silicacapture, SC) oraz izolację RNA z wykorzystaniem komercyjnego zestawu (Rn). Badania wykazafy, że zastosowanie do amplifikacji preparatów przygotowa­nych każdą z wymienionych metod umożliwia wykrycie CMV. Identyfikację i gru­powanie badanych izolatów wykonano za pomocą: metody ELISA z użyciem grupo­wo-specyficznych przeciwciał monoklonalnych, analizy filogenetycznej sekwencji genu białka płaszcza oraz analizy restrykcyjnej zamplifikowanych fragmentów RNA2 i RNA3 wirusa poddawanych działaniu enzymów restrykcyjnych EcoRI, HpaII i MluI. Zastosowane przeciwciała monoklonalne umożliwił wstępną klasyfikację 14 izolatów do grupy I lub II, jednakże nie reagowały one z izolatem P26. Analiza se­kwencji genu białła płaszcza umożliwił identyfikację wszystkich badanych izolatów oraz przyporządkowanie ich do grupy IA lub II. Wyniki klasyfikacji izolatów uzyska­ne po analizie restrykcyjnej były zgodne z wynikami grupowania otrzymanymi w analizie filogenetycznej.