A method for the simultaneous determination of vitamin A (all-trans-retinol) and vitamin E (α-tocopherol) in milk using the HPLC technique with UV detection (324 nm, vitamin A) and fluorescent detection (Ex295 nm/Em350 nm, vitamin E) was validated. A reverse phase LiChroCART™ 250-4 Superspher™ 100 RP-18 column was used for chromatographic separation. A mixture of methanol and H2O (96.5:3.5 v/v) was used as the eluent (1 mL/min). The analyses were performed after spectrophotometric standardization of standard ethanol solutions, and the results were corrected by recovery. The residual coefficients of variation for the regression equation y=ax were 4.7% (vitamin A) and 8.3% (vitamin E), with r2 > 0.998 (for both vitamins). The limit of quantitation was 0.02 μg/mL and 0.3 μg/mL, repeatability and reproducibility 14% and 12.5%, and uncertainty of the method 20.7% and 18.8% for vitamins A and E, respectively. Vitamin recovery from milk was 51.6-75.1% (vitamin A) and 70.1-87.8% (vitamin E). The results of the reference material analyses (CRM 421, SRM 2383) concur with the certified reference values. The analytical method described is precise, accurate, fast and inexpensive.
Zwalidowano metodę jednoczesnego oznaczania witaminy A (all-trans-retinol) i witaminy E (α-tokoferol) w mleku techniką HPLC z detekcją UV (324 nm, witamina A) i fluoroscencyjną (Ex295 nm/Em350 nm, witamina E). Do rozdziału chromatograficznego użyto kolumny LiChroCART™ 250-4 Superspher™ 100 RP-18. Jako eluent (1 mL/min) zastosowano mieszaninę metanolu z H2O (96,5:3,5 v/v). Alkoholowe roztwory próbek analizowano po uprzednim zmydleniu witamin (KOH, 60%, m/v, 70°C, 60 minut) w środowisku etanolu, wysoleniu, ekstrakcji (octan etylu i heksan, 1:9, v/v) górnej warstwy mieszaniny, odparowaniu pod azotem i rozpuszczeniu pozostałości w etanolu. Wyniki analiz korygowano o wcześniej wyznaczony odzysk (51,6-75,1%, witamina A i 70,1-87,8%, witamina E). Resztowe współczynniki zmienności równania regresji y=ax wynosiły 4,7% (witamina A) i 8,3% (witamina E), a r2 > 0,998 (dla obu witamin), granica oznaczenia ilościowego 0,02 μg/mL i 0,3 μg/mL, powtarzalność i odtwarzalność 14% i 12,5%, a niepewność metody 20,7% i 18,8%, odpowiednio dla witaminy A i E. Wiarygodność metody potwierdzono na materiałach referencyjnych (CRM 421 i SRM 2383). Opisana metoda analityczna, jest precyzyjna, dokładna, szybka i tania.
