W pracy opisano syntezę nowych połączeń muramylodipeptydu (MDP), nor-muramylodipeptydu (nor-MDP) oraz desmuramylopeptydu z aminowymi pochodnymi 1-nitroakrydyny/4-nitroakrydonu, N-(hydroksyalkilo)-4-karboksyamido-akrydyny/9-akrydonu, batracyliną i jej pochodnymi oraz tuftsyną i tuftsyną o odwróconej sekwencji. Pochodne MDP i nor-MDP (estry ten-butylowe 4,6-0-benzylideno-1-O-benzylo-N-acetylo-muramylo-(lub nor-muramylopeptydów) - substraty do syntezy koniugatów - otrzymywano metodami literaturowymi z pewnymi modyfikacjami, np. usuwanie z funkcji karboksylowej osłony ten-butylowej za pomocą 90% TFA umożliwiło w temperaturze pokojowej równocześnie odszczepienie grupy benzylidenowej z C6 i C4. Tak otrzymanymi pochodnymi 1-O-benzylo-MDP i 1-O-benzylo-nor-MDP, bez oczyszczania, acylowano aminowe czy hydroksylowe pochodne akrydyny, akrydonu, batracyliny oraz tuftsyny. Pośród prezentowanych 56 nowych koniugatów znajdują się 24 połączenia otrzymane przez utworzenie wiązania amidowego pomiędzy grupą karboksylową izoglutaminy a aminowymi pochodnymi 1-nitroakrydyny/4-nitroakrydonu. Reakcje prowadzono w bezwodnym DMF wg trzech procedur: DPP Ą mieszanych bezwodników i EEDQ. Kolejne 3 koniugaty to połączenia desmuramylopeptydów z pochodnymi amino-1-nitroakrydyny lub 9-akrydonu. Dwa z nich zawierały kwas mezodiaminopimelinowy, a w trzecim L-alaninę zastąpiono L-waliną zaś kwas mezo-diaminopimelinowy L-lizyną. Kwas mezo-diaminopimelinowy potrzebny do syntezy desmuramylopeptydów otrzymano z całkowicie chronionego kwasu pimelinowego, wykorzystując a-chymotrypsynę do selektywnej hydrolizy grupy estrowej przy centrum S. Pochodne amino-1-nitroakrydyny/4-nitroakrydonu otrzymano znanymi sposobami w wyniku kondensacji UlImana kwasu o-chlorobenzoesowego z m-nitroaniliną lub 3-amino-4-nitrochlorobenzenem w obecności pyłu miedzi jako katalizatora, cyklizacji i łączeniu z odpowiednimi alkiloaminami. Dziewięć nowych koniugatów MDP lub nor-MDP zsyntetyzowano, modyfikując ich C-koniec przez utworzenie wiązania estrowego z pochodnymi N-(hydroksyalkilo)-4-karboksyamido-akrydyna/9akrydonu. Do syntezy wykorzystano HBTU lub EDCI jako odczynniki kondensujące. Nadmiar jednego z substratów ułatwił otrzymywanie produktu z umiarkowaną wydajnością. Kwas 9-akrydono-4karboksylowy i kwas akrydyno-4-karboksylowy, substraty do otrzymania tego typu koniugatów zsyntetyzowano wg znanych procedur i łączono je z odpowiednimi aminoalkoholami, stosując DPP A lub CDI, otrzymując pochodne N-(hydroksyalkilo)-4-karboksyamido-akrydyny/9-akrydonu. Podjęto również próby zastosowania reakcji Mitsunobu do tworzenia wiązania estrowego pomiędzy MDP lub nor-MDP a pochodnymi N-(hydroksyalkilo)-4-karboksyamido-9-akrydonu. Próby zakończyły się niepowodzeniem pomimo wielu doświadczeń w zmienianych warunkach reakcji, stosowania różnych nadmiarów molowych substratów i zmiennej kolejności dozowania reagentów. Koniugaty zawierające pochodne akrydyny/akrydonu przekazano do badań aktywności cytotoksycznej w Narodowym Instytucie Rakowym (NCI, Bethesda, USA). Siedem połączeń MDP lub norMDP z pochodnymi amino-I-nitroakrydyny wykazało wysoką aktywność cytotoksyczną i zostało zakwalifikowane do badań in vivo w teście Hollow Fiber. Najbardziej aktywne koniugaty działają cytotoksycznie na komórki nowotworu piersi, nerki, jajnika, czerniaka, okrężnicy, płuc i prostaty. Na podstawie testów in vivo Hollow Fiber trzy z nich zostały wyselekcjonowane, przez Komitet Oceny Biologicznej NCI, do bardziej zaawansowanych testów in vivo na ksenoprzeszczepach (xenograft assays). Analogi desmuramylopeptydów z pochodnymi amino-I-nitroakrydyn oraz analogi MDP lub nor-MDP zawierające pochodne N-(hydroksyalkilo)-4-karboksyamido-akrydyny lub akrydonu okazały się nieaktywne. Zsyntetyzowano 8 koniugatów MDP lub nor-MOP z batracyliną lub jej pochodnymi. Reakcję acylowania prowadzono w bezwodnym DMF według dwóch procedur: DPPA i EEDQ. Opracowano udoskonaloną metodę syntezy batracyliny. Jako substrat wykorzystano komercyjną p-fenylenodiaminę, którą przeprowadzono w pochodną symetrycznie chronioną grupami acetylowymi lub uretanowymi, po czym poddano reakcji Czerniaka-Einhorna i w wyniku późniejszego usunięcia grup ochronnych uzyskano batracylinę (BAT) z dobrymi wydajnościami. Ta modyfikacja zmniejszyła liczbę etapów i ułatwiła skomplikowaną dotychczas syntezę batracyliny. Pochodne batracyliny [N-(N-Boc-aminokwas)]-BAT otrzymano, stosując DCC lub EEDQ w bezwodnym chlorku metylenu. Koniugaty MDP zawierające batracylinę zostały skierowane do badań aktywności cytotoksycznej w Narodowym Instytucie Rakowym (NCI, Bethesda, USA) oraz w Katedrze Histologii i Immunologii Akademii Medycznej w Gdańsku. Z oznaczeń przeprowadzonych w NCI wynika, że związki te w badanym zakresie stężeń 10^-4 - 10^-8 M są nieaktywne w rutynowych testach tego ośrodka. Celem badań w Katedrze Histologii i Immunologii Akademii Medycznej w Gdańsku było oznaczenie immunomodulacyjnych właściwości tych koniugatów wobec subpopulacji leukocytów krwi obwodowej hodowanych w obecności komórek linii nowotworowych (K562, WEHI 164, Ab). Stwierdzono, że 3 koniugaty właściwościami hamowania rozwoju komórek wybranych linii nowotworowych przewyższają batracylinę, wydają się więc obiecującymi związkami, które w przyszłości mogą znaleźć zastosowanie jako leki. Ich skuteczność musi być jednak zweryfikowana na modelu zwierzęcym. Zsyntetyzowano 6 koniugatów MDP lub nor-MDP z tuftsyną (H- Thr-Lys-Pro-Arg-OH) i 6 koniugatów MDP lub nor-MDP z pochodnątuftsyny o odwróconej sekwencji (H-Arg-Pro-Lys-Thr-OMe). Do syntezy zarówno pochodnych tuftsyny, jak i ich koniugatów z MDP lub nor-MDP wybrano azydofosforan difenylu (DPP A) jako odczynnik kondensujący oraz metodę mieszanych bezwodników. W Katedrze Histologii i Immunologii Akademii Medycznej w Gdańsku przeprowadzono badania koniugatów MDP z tuftsyną, tuftsyny handlowej (firmy Bachem), pochodnej nitrotuftsyny (H-Thr-Lys-Pro-Arg(NOz)-OH) i nor-MDP, których celem było: ocena wpływu koniugatów na żywotność mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC), limfocytów krwi obwodowej (PBL) i monocytów, ocena sekrecji czynnika martwicy nowotworu (TNF.J i interleukiny 6 (IL6) w hodowlach komórek stymulowanych badanymi związkami, zbadanie wpływu na cytotoksyczność naturalnych komórek zabójczych (NK) oraz ocena wybuchu tlenowego w subpopulacjach krwi obwodowej pod wpływem badanych związków. Badania wykazały, że zaletą testowanych związków (w szczególności nitrotuftsyny) było ich szybsze działanie i większa skuteczność w porównaniu do tuftsyny. Planowane testy in vivo na modelu zwierzęcym mogą potwierdzić potencjalną użyteczność tych połączeń. Struktura otrzymanych koniugatów została potwierdzona na podstawie widm NMR (500 MHz), analizy elementarnej i jakościowej analizy na płytkach TLC.
56 new conjugates of muramyl dipeptide (MDP), nor-muramyl dipeptide (nor-MDP) or desmuramylpeptides with compounds of determine or potential biological activity (anticancer or immunostimulant), e.g. amino-l-nitroacridinel4-nitro-9-acridone derivatives 56a-z, 72a,b, 77, N-(hydroxyalkil)-4-carboxyamide-acridine/9-acridone 7Sa-i, batracylin and its derivatives 122a-h or tuftsin and its derivative 126a-f, 129a-f have been synthesized. Practically for every group of the conjugates it was necessar to develop specific conditions for synthesis and purification of the reaction products. MDP or nor-MDP derivatives, needed for the synthesis of the conjugates, were prepared according to the method proposed by Flowers and Jeanloz [25] with some modifications described in chapter 5.1. (Scheme 7). It was an essential fragment of my work to prove that MDP derivatives presented in the dissertation contain isoglutamine residue. The literature data shows that removing the ester group type OBn and OMe from the [gama]- or [alfa]-carboxylic group of the isoglutamine or glutamine residues under alkaline hydrolysis. conditions leads to cyclic glutarimide. In fact, the hydrolysis of isoglutamine ester under anhydrous conditions (IN KOH/MeOH in dry 1,4-dioxane) gives the glutarimide derivative 50 (Scheme 7). However, it turned out that the use of such derivatives for acylation of amines or alcohols under the conditions described in this work gave a structure containing the isoglutamine residue. This was proven by structure analysis of the products employing high resolution NMR spectroscopy, 2D-COSY, heterocorrelated HMBC and HSQC spectra. I also obtained the same products using MDP containing free carboxyl group - a product of hydrolysis of tert-butyl MDP esters. Treating the protected MDP or nor-MDP tert-butyl esters with 90% TFA for 20 min caused the removal of both tert-butyl and 4,6-benzylidene groups (Scheme 7). 1-Benzyl-MDP or 1-benzyl-nor-MDP without purification were used for synthesis of conjugates with amine or hydroxy-acridine/acridone derivatives, batracylin or tuftsin. In my dissertation I present the synthesis of 24 conjugates of MDP or nor-MDP modified at the C-terminal part by formation of an amide bond between the isoglutamine carboxylic group and the amine function of acridinelacridone derivatives 56a-z (Table 2). Synthesis of three analogues of desmuramyl-peptides, 72a,b, 77 (Table 4), modified at C-end with an amino-acridinelacridone residue was also reported. Moreover, two other analogues, 72a,b, containing meso-diaminopimelic acid; and one more analogue with L-alanyl instead of L-valine and meso-diaminopimelic acid instead of L-lysine were described 77 (Table 4). The screening data indicate that the analogues 72a,b, 77, and 78a-i exhibit low cytotoxic activity, whereas a large number of others (56a-z) are potent in vitro cytotoxic agents against a panel of human cell lines. Seven compounds of this group, 56b,c,e,g,h,i,I, were selected by the NCI Biological Evaluation Committee for evaluations by mean of in vivo Hollow Fiber assay and three of them, 56b,e,h, passed the test for further evaluation in subcutaneous human tumor xenograft assays. I developed a convenient procedure for preparation of 7-methyl or p-nitrobenzyl ester of (6R)Z-(2S)-Boc-meso-A2pm, a key substrate for synthesis of several biological active peptides. Dibenzy-loxycarbonyl-meso-diaminopimelic acid 15 [126], after convertion into dimethyl or di-p-nitrobenzyl ester 52 (Scheme 8), was selectively hydrolyzed at the S-center using a-chymotrypsin, followed by transformation into N-carboxyanhydride 54. Then the acidic hydrolysis with 10% AcOH in THF and Boc-protection of the amino group at the S-center allowed me to obtain the selectively protected meso-A2pm 55 with free carboxyl group, ready for coupling at the S-center [53]. Compound 55 was used for the synthesis of the conjugates of desmuramylpeptides with amino-1-nitro-acridine/acridone derivatives 72a,b (Scheme 12, Reaction A). Furthermore, 1 synthesized 9 new analogues of MDP or nor-MDP modified at the C-end with the 4-carboxamide-hydroxyalkyl-acridine/9-acridone derivatives 78a-i. Unexpectedly, the formation of the ester bond between the carboxyl group of isoglutamine belonging to MDP molecule and the hydroxyl group of 4-carboxamide-hydroxyalkyl-acridine/9-acridone turned out to be very difficult. When popular coupling reagents such us DCC, EEDQ, CCBT, CCMT were used, the reaction yields hardly exceeded 5%. After many attempts I have found reaction conditions enabling the preparation of these products with a yield of about 35-40%. The results have been achieved thanks to the utilization of HBTU or EDCI as coupling reagents and the application of 2-fold surplus of the hydroxy component (Scheme 13). The 4-carboxamide-acridine/9-acridone derivatives were obtained according to Scheme 14. Acridine-4-carboxylic acid 82 was prepared by reduction of the corresponding 9-acridone-4-carboxylic acid 81 with aluminumlmercury amalgam, followed by FeCh reoxidation of the resulting acridans. Both acids (81 and 82) were condensed with amino alcohols in DMF by means of either DPP A or 1,1' -carbonyldiimidazole. Structures of all products were established on the basis of NMR spectra and microanalyses (Table 5). Conjugates 78a-i containing 4-carboxamide acridine or 9-acridone display no anticancer activity. In an attempt to use the Mitsunobu reaction for the acylation of N-(hydroxyalkyl)-9-acridone-4-carboxamide with muramyl dipeptide (MDP) or nor-muramyl dipeptide (nor-MDP), heterocyclic derivatives, oxazoles and oxazines were isolated instead of the expected esters. Although various molar proportions and orders of adding of the reagents were applied, ester formation was not observed. Oxazoles and oxazines were, in my opinion, formed as a result of intramolecular cyclization independently of the presence of an acidic component, Le. MDP or nor-MDP, in the reaction mixture. The mechanism of the reaction has been proposed. I have synthesized MDP and nor-MDP conjugates modified at the peptide residue with batracylin or its derivatives [60]. These conjugates, 122, were synthesized from partially protected MDP or nor-MDP 51 by means of DPP A as a coupling agent in the presence of TEA (Scheme 25, Table 11). I present a considerable modification of the batracylin synthesis (Scheme 24). In the improved method symmetrically protected l,4-phenylenediamine was used as a starting reagent. This made it possible to eliminate the most difficult steps of the hitherto existing synthesis and increase the product yield to 70 - 80% (after crystallization) [176]. The activity of these conjugates was evaluated at the Medical University of Gdansk on subpopulations of leukocytes isolated from venous blood cultures in the presence of tumour cells: K562 (human leukaemia), WEHl (mouse fibrosarcoma), Ab/Ma (hamster melanoma). The intensity of tumour cell death was measured by means of flow cytometry using subG 1 peak. Differentiation between apoptosis and necrosis was assessed using gel electrophoresis of DNA eluted from dead cells. Three conjugates, 122c, 122e, 122h, seem to be promising immunomodulators that could be used as medicines in the future. However, their effectiveness has to be verified on the animal model. I have also synthesized six conjugates of muramyl dipeptide (MOP) or nor-muramyl dipeptide (nor-MDP) with tuftsin (H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH) (Scheme 27, Table 13) [194,195], and six conjugates of MOP or nor-MOP with retro-tuftsin (H-Arg-Pro-Lys-Thr-OMe) [196] (Scheme 28, Table 15). Also a tuftsin analog (H-Thr-Lys-Pro-Arg(NO2)-OH), 124, was obtained. The idea of the preparation of these conjugates was based on the assumption that the activity of the product would combine the biological activities of both tuftsin and MOP, or even enhance them, thanks to synergistic properties of MOP. The activity of tuftsin is generally directed toward the activation of non-specific elements of the immune system. It mainly stimulates the synthesis of free radicals by granulocytes and, to a lesser extent, by monocytes. Another action of tuftsin is connected with the secretion of cytokines by monocytes. On the other hand, MOP is much more deeply engaged in the stimulation of monocytes. It is believed that MOP, a fragment of bacterial cell wall peptidoglycan, acts via lipopolisaccharide receptor CO14 and via Toll-like receptors to stimulate a wide range of immune system elements. So, it was my intention to combine the effects of both these immunostimulants together. All the synthesized conjugates 1263-f, as well as nor-MOP and 124, were tested at the Department of Histology and Immunology, Medical University of Gdansk, Poland. The biological activity of the examined compounds was estimated using in vitro cultures of human monocytes and lymphocytes. The subtances displayed cytotoxic effects, as was revealed in the performed viability tests. The effects were most probably mediated by induction of the oxidative burst in monocytes and stimulation of redox enzymes in lymphocytes. In addition, the analogues turned out to be efficient stimulators of TNFa and IL6 secretion by monocytes and Iymphocytes. Nevertheless, the secretion of cytokines did not affect the viability of the leukocyte population used in the experiments. The beneficial properties of the examined compounds (mainly 124, 1263 and 126c), which imply their usefulness as potential therapeutic agents, are connected with their quick start of action and greater effectiveness as compared with tuftsin alone. An assay in vivo on animal models will be performed. The final products were isolated and purified by means of column chromatography on silica gel or radial chromatography. In some cases, when further purification was needed a preparative TLC was employed. The composition of the conjugates was confirmed by the analysis of NMR spectra, elemental analysis, and by TLC quantitative amino acid analysis.
