Sepharose-DTNB covalent affinity chromatography of hepatic metallothionein from Cu-treated rats

Covalent affinity chromatography with thiol-disulphide interchange (CAC-- TDI) on Sepharose-DTNB gel was employed for separation of Cu-thionein (Cu-Th) from the łivers of Cu induced white rats (3.0 mg of Cu per kg body weight, administered subcutaneously in physiological saline). Cu-thionein was prepared by gel permeation chro-matography (GPC) on Sephadex G-200 geł. The metallothionein protein (MT) was fractionated by two-, three- and four-step elutions. The CU(2+) ion dissociated fi.om Cu-thionein and protein aggregated by thiol-thiol intermolecular oxidation and mercaptide bonds (oligoaggregates and polyaggregates) and intramolecular formation of disulphide and mercaptide bridges in the lightmass monomer resulted from the contact with cova-lent affinity chlomatography support, inferred from rechromatoglraphy on Sephadex G-200. The dissociated CU(2+) appeared as a light complex with DTNB in fractions about 2000-2800 Da mass.

---

Metodę chromatografii powinowactwa kowalencyjnego z wymianą mostków disiarczkowych (CAC- TDI) na złożu Sepharose-DTND stosowano do rozdziału Cu-tioneiny (Cu- Th) z wątroby białych szczurów eksponowanych przy użyciu Cu (3.0 mg Cu na kg wagi ciała, w postaci CUSO4 podawanego podskórnie w roztworze soli fizjologicznej). Cu-tioneina była otrzymywana metodą klasycznej chromatografii żelowej (GPC) na żelu Sephadex G-200. Białko metalotioneinowe frakcjonowano przy użyciu dwu-, trój- i czterostopniowej elucji. Podczas rozdziału jony CU2+ dysocjowały z Cu-tioneiny i powstały agregaty białkowe w wyniku utleniania grup tiolowych oraz tworzenia się wiązań merkaptydowych (oligoagaty i poliagregaty). W wyniku kontaktu ze złożem do chromatografii powinowactwa kowalencyjnego powstawały także wewnątrzcząsteczkowe mostki disiarczkowe oraz merkaptydowe w monomerach o niskiej masie cząsteczkowej, co potwierdzano rechromatografując powstałe frakcje na żelu Sephadex G-200. Dysocjujące jony Cu(2+) występowały w niskocząsteczkowej frakcji, jako kompleksy z DTNB o masie w granicach 2000 --28OO Da.