Badania nad syntezą i właściwościami inhibitorów oraz substratów amoniakoliazy fenyloalaniny

W ramach przeglądu literaturowego przedstawiono budowę, mechanizm działania i inhibitory enzymu roślinnego - amoniakoliazy fenyloalaniny. Podstawową część pracy stanowią badania własne, obejmujące projektowanie i opracowanie metod syntezy inhibitorów oraz substratów tego enzymu. Otrzymano siedemdziesiąt trzy analogi fenyloalaniny, fenyloglicyny i kwasu (E)-cynamonowego. Związki te odznaczały się dużą różnorodnością pod względem rodzaju grup funkcyjnych oraz struktury szkieletu węglowego. Najliczniejszą wśród nich grupę stanowiły kwasy fosfonowe. Otrzymane związki zbadano jako potencjalne inhibitory lub substraty amoniakoliazy fenyloalaniny oraz jako inhibitory biosyntezy antocyjanin. Dwa z nich - kwas 2-aminoindano -2-fosfonowy oraz kwas (+)-l-amino-3',4' dichlorobenzylofosfonowy - okazały się bardzo silnymi inhibitorami zarówno amoniakoliazy fenyloalaniny, jak i biosyntezy antocyjanin. Pierwszy z tych związków, kwas 2-aminoindano-2-fosfonowy, jest obecnie powszechnie używanym w laboratoriach inhibitorem in vivo amoniakoliazy fenyloalaniny. Pochodne kwasu 1 -aminobenzylo-fosfonowego zawierające w pierścieniu różne podstawniki otrzymano w reakcji amidoalkilowania trójwartościowych związków fosforu lub hydrofosfonylowania podstawionych N-benzylidenodifenylometyloamin. Metoda hydrofosfonylowania wydaje się wygodniejszą drogą syntezy, chociaż efekty steryczne mogą stanowić czynnik ograniczający jej zastosowanie. Wartości stałych inhibicji (K,) dla całej serii podstawionych w pierścieniu benzenowym pochodnych kwasu 1-amino-benzylofosfonowego pozwalają przypuszczać, że wielkość hydrofobowej kieszeni substratu w cząsteczce amoniakoliazy fenyloalaniny jest ograniczona. Badając analogi kwasu (š)-2-aminooksy -3-fenylopropionowego, wysunięto hipotezę, że silne właściwości inhibitorowe związku macierzystego są związane z możliwością utworzenia dodatkowego wiązania wodorowego między parą elektronową atomu tlenu grupy aminooksylowej a enzymem. Opracowano modyfikację literaturowej metody syntezy analogów kwasu (E)-cynamonowego zawierających grupę fosfonawą z alkenów i pentachlorku fosforu, która pozwala skrócić ich syntezę o jeden etap. Znaleziono błąd w opublikowanej metodzie syntezy kwasu 2-fenyloetynylofosfonowego - produktem tej reakcji jest kwas 2-fenylo-2-oksoetylofosfonowy. Żaden spośród badanych analogów kwasu (E)-cynamonowego nie okazał się silnym inhibitorem. Wiele podstawionych pochodnych kwasu (E)-cynamonowego jest natomiast substratami w biosyntezie in vitro podstawionych pochodnych (.S)-fenyloalaniny. Wyniki obliczeń teoretycznych sposobu wiązania kwasu 2-aminoindano-2-fosfonowego do modelu amoniakoliazy fenyloalaniny wskazują, że bardziej uprzywilejowany jest konformer z pseudoaksjalną grupą fosfonową. Badania kwasu 2-aminoindano-2-fosfonowego w ciele stałym, w roztworze i obliczenia dla cząsteczki izolowanej wskazują natomiast, że preferowana jest konformacja z grupą fosfonową w pozycji pseudoekwatorialnej. Inhibitor podczas przejścia z roztworu do miejsca aktywnego enzymu musi zatem zmienić konformację z pseudoekwatorialnej na pseudoaksjalną. Otrzymane wyniki obliczeń są zgodne z wynikami badań eksperymentalnych. Można przypuszczać, że z powodu zmiany konformacji cząsteczki kwas 2-amino-indano-2-fosfonowy jest inhibitorem wolnowiążącym.

---

Studies on the design and syntheses of new inhibitors and substrates for an important plant enzyme -phenylalanine ammonia-lyase (PAL) - have been reported. In the introduction, the papers on the structure of PAL, mechanism of action and known inhibitors are reviewed. Own results concerning the methods of syntheses of new inhibitors and substrates for PAL are a crucial part of the monograph. Seventy three analogues of phenylalanine, phenylglycine and (E)-cinnamic acid were obtained and examined. These compounds differ in the structure of carbon skeletons as well as in their functional groups. Among them, the largest library is represented by phosphonic acids. All the compounds obtained were evaluated as inhibitors or substrates of PAL and, additionally, as inhibitors of anthocyanin biosynthesis. Two of them, namely, 2-aminoindane -2-phosphonic acid and (+)-l-amino-3',4'-dichlorobenzyl-phosphonic acid were found to be strong inhibitors for both studied pathways. Thus introduced, 2-aminoindane-2-phosphonic acid (AIP) is now commonly used in many laboratories around the world as the preferred in vivo inhibitor of PAL. 1 -Aminobenzylphosphonic acid derivatives possessing different substitutents at the aromatic ring were obtained in amidoalkylation reaction of trivalent phosphoric acid derivatives or hydrophosphonylation of N-benzylidenediphenylmethylamine derivatives. The method of hydrophosphonylation is considered as the preferred one. However, in some cases, hindered diethyl 1-diphenylmethylaminoalkylphosphonates in the next acidic hydrolysis underwent decomposition to products of the retro Kabachnik-Fields reaction instead of yielding the corresponding 1 -aminoalkylphosphonic acids. The values of enzyme inhibition constants (K) for all studied 1-aminobenzylphosphonic acid derivatives suggest that size of a hydrophobic pocket of PAL is narrow. Studies of (š)-2-aminooxy-3-phenylpropionic acid analogues suggest that the strong inhibition of PAL by these compounds is due to the additional hydrogen bonding between the enzyme and the inhibitor. The synthesis of analogues of (E)-cinnamic acid with phosphonous group from alkenes and pentachlorophosphorous, described in literature, is shortened by one step. The product formed in hydrolysis of diethyl 2-phenylethynylphosphonate is 2-oxo-2-phenylethylphosphonic acid, not as reported in the literature, 2-phenylethynylphosphonic acids. The modified synthetic procedure gives the proper product. None of twenty nine evaluated compounds with the structure related to the structure of (E)-cinnamic acid is a strong inhibitor of PAL. On the other hand, many substituted (E)-cinnamic acid derivatives were found to be substrates for in vitro biosynthesis of (S)-phenylalanine derivatives. Theoretical studies of the mode of 2-aminoindane-2-phosphonic acid bonding to the PAL model suggest that the conformer of the inhibitor with the pseudoaxial phosphonic group is the most preferred one. All structural studies of 2-aminoindane-2-phosphonic acid (X-ray, NMR and theoretical calculation) indicate that the preferred conformation is that with the pseudoequatorial phosphonic acid group. This means that the inhibitor in the process of bonding has to change its pseudoequatorial conformation to a pseudoaxial one. This finding is offered as an explanation for the fact that 2-aminoindane-2-phosphonic acid is a slow binding inhibitor.