The search for mitochondrial polymorphisms differentiating cytoplasmic male-sterile and male-fertile beets

The research was aimed at the identification of mitochondrial DNA (mtDNA) and protein features which differentiated cytoplasmic male-sterile (CMS) and malefertile beets. The analysis encompassed CMS and maintainer lines of sugar beet, table (red) beet and fodder beet. The polymorphic mtDNA sequences were searched with the use of both RAPD- and vectorette PCR. The latter method was adopted for the analysis of plant mtDNAs by designing a series of universal mitochondrial primers (UMPs). The search resulted in the identification of 26 cytoplasm-specific markers – 5 RAPDs and 21 vectorette markers. A selection of these markers was subjected to cloning and sequencing. This revealed a few mtDNA sequence arrangements which were missing in the whole genome sequence records available in the databases. Specificity of the identified RAPD and vectorette markers was also verified with the use of next generation sequencing (NGS) – by mapping mitochondrial NGS reads to the marker sequences. Moreover, the RAPD and vectorette marker sequences were used to design plasmotype-specific SCAR markers. Five of these markers proved to be useful for the differentiation of S- and N-cytoplasmic beets. Finally, a proteomic study was performed in order to search for proteins associated with CMS in beets. The comparison of 2-DE protein maps revealed 13 proteins, which in certain genetic background(s) showed plasmotype association. One of these proteins – CBSX3 – was earlier linked with male sterility in Arabidopsis thaliana.

Celem badań była identyfikacja cech mitochondrialnego DNA (mtDNA) i proteomu, które różnicowały cytoplazmatycznie męskosterylne (CMS) i męskopłodne formy buraka. Analizami objęto linie CMS i dopełniające buraka cukrowego, ćwikłowego oraz pastewnego. Do poszukiwania polimorficznych sekwencji mtDNA wykorzystano techniki RAPD- i vectorette PCR. Drugą z tych metod zaadaptowano do analizy roślinnych mtDNA poprzez zaprojektowanie zestawu uniwersalnych starterów mitochondrialnych (UMP). W wyniku przeprowadzonych badań zidentyfikowano 26 markerów plazmotypowo-specyficznych – 5 typu RAPD i 21 typu vectorette. Część tych markerów poddano klonowaniu i sekwencjonowaniu. W ten sposób wykryto kilka układów sekwencji mtDNA, których nie zawierały dostępne w bazach danych rekordy sekwencyjne całych genomów. Specyficzność zidentyfikowanych markerów RAPD i vectorette zweryfikowano także przy użyciu sekwencjonowania następnej generacji (NGS) – poprzez mapowanie mitochondrialnych odczytów NGS do sekwencji markerowych. Ponadto sekwencje markerów RAPD i vectorette zostały wykorzystane do zaprojektowania plazmotypowo-specyficznych markerów SCAR. Wykazano, iż pięć spośród tych markerów nadaje się do różnicowania roślin S- i N-plazmatycznych. Na koniec przeprowadzono analizy proteomiczne, w których poszukiwano białek związanych z cechą CMS u buraka. Porównując białkowe mapy 2-DE, znaleziono 13 białek, które w pewnym kontekście genetycznym wykazywały związek z plazmotypem. Jedno z tych białek – CBSX3 – było wcześniej wiązane z męską sterylnością u Arabidopsis thaliana.