Bibliography
Flotillin-1 and flotillin-2 are ubiquitously expressed proteins which are N-myristoylated and/or S-palmitoylated. Thanks to these acylations, flotillins bind to the cytoplasmic leaflet of plasma membrane nanodomains, rafts. Moreover, flotillins undergo homo- and hetero-oligomerization and interact with numerous proteins. Therefore, flotillins can act as scaffolding proteins, facilitating the assembly of multiprotein submembrane complexes involved in various cellular processes.The main objective of this study was to reveal the role of flotillins and their S-palmitoylation in TLR4 signaling triggered by bacterial lipopolysaccharide (LPS). TLR4 initiates a pro-inflammatory response aiming at the eradication of bacteria which can lead to fatal sepsis, fueling interest in TLR4 signaling. The rationale for undertaking the studies was: (1) results of our mass spectrometry analysis, which showed that the amount of palmitoylated flotillin-1 increased in LPS-stimulated Raw264 macrophage-like cells, suggesting its participation in LPS-triggered signaling; (2) a line of data indicating that flotillins are involved in endocytosis and cellular trafficking of raft proteins. A typical raft protein is CD14 which assists activation of TLR4 by LPS. It was assumed that flotillins can affect LPS-induced signaling due to possible interplay with CD14.To achieve the goal, lentiviral particles were used to deliver flotillin-2-specific shRNA into Raw264 cells. Several clones of cells stably depleted of flotillin-2 were obtained, which were also found to be deficient in flotillin-1. In flotillin-depleted cells, the LPS-induced responses were diminished. The TRIF-dependent signaling pathway of TLR4 leading to activation of the IRF3 transcription factor was inhibited and the subsequent production of chemokine CCL5/RANTES was reduced. The MyD88-dependent signaling leading to the activation of the NFκB transcription factor and production of cytokine TNFα was also reduced. However, the latter effect was most pronounced in cells stimulated with low LPS concentration which requires the participation of CD14. Indeed, depletion of flotillin-1 and -2: (i) lowered CD14 mRNA level; (ii) reduced the total cellular level of CD14; (ii) decreased the amount of CD14 on the cell surface. Notably, no such changes were observed for TLR4. On the other hand, forced clustering of CD14 in the plasma membrane (the first effect of LPS binding) induced S-palmitoylation of flotillin-1 and flotillin-2, indicating mutual interactions of flotillins and CD14. Co-expression of flotillins with 23 members of the zDHHC family revealed that zDHHC5 and zDHHC8 can S-palmitoylate flotillins. After silencing of Zdhhc5 or Zdhh8, it was found that zDHHC5 participation is required for a response to LPS triggered in both TLR4 signaling pathways, with emphasis on the TRIF-dependent pathway, which may be linked with zDHHC5 involvement in S-palmitoylation of flotillins. Taken together, the data indicate that flotillins modulate the cellular level of CD14 and interact (indirectly) with CD14, thereby affecting the intensity of the LPS-induced pro-inflammatory response. Flotillins are likely to be involved in CD14 endocytosis and recycling, as well as in the transport of newly synthesized CD14 to the plasma membrane, all events may be regulated by S-palmitoylation of flotillins catalyzed among others by zDHHC5. The above results were obtained, i.a., owing to the development of a modification of a technique for detecting palmitoylated protein. It involves enrichment of 17ODYA (palmitic acid analogue)-labeled proteins and their recovery from streptavidin-coupled beads allowing simultaneous identification of several endogenous and overproduced palmitoylated proteins. The technique was used in a study conducted in collaboration with the Institute of Molecular Genetics ASCR in Prague and allowed the detection of S-palmitoylation of OPAL1, an adaptor protein of leukocytes, likely to be located in rafts.
Streszczenie w języku polskim
125 pages : illustrations ; 30 cm
125 stron : ilustracje ; 30 cm
Summary in Polish
Bibliografia
Flotylina-1 i flotylina-2 są podbłonowymi białkami, które ulegają N-mirystoilacji i/lub S-palmitoilacji i wiążą się z nanodomenami błony komórkowej, tzw. tratwami. Flotyliny tworzą homo- i hetero-oligomery, a także oddziałują z licznymi białkami. Zatem, flotyliny mogą pełnić rolę białek rusztowaniowych, ułatwiających formowanie kompleksów podbłonowych biorących udział w różnorodnych procesach komórkowych.Głównym celem podjętych badań było ujawnienie roli flotylin i ich S-palmitoilacji w szlakach sygnałowych receptora TLR4 aktywowanego przez bakteryjny lipopolisacharyd (LPS) w makrofagach. TLR4 inicjuje kaskadę prozapalną mającą na celu eliminację bakterii, która jednak może prowadzić do sepsy, co wzbudza zainteresowanie molekularnymi mechanizmami aktywacji TLR4. Uzasadnieniem podjęcia badań były: (1) wyniki naszej analizy spektrometrii mas, która wykazała, że ilość palmitoilowanej flotyliny-1 wzrasta w komórkach Raw264 linii makrofagopodobnej stymulowanych przez LPS, co sugeruje udział tego białka w indukowanych szlakach sygnałowych; (2) dane wskazujące, że flotyliny biorą udział w endocytozie i transporcie komórkowym białek tratw błonowych. Typowym białkiem tratw jest CD14, które wspomaga aktywację receptora TLR4 przez LPS. Założono, że flotyliny mogą wpływać na szlaki sygnałowe indukowane przez LPS ze względu na możliwe oddziaływania z białkiem CD14.Aby zrealizować cele badawcze zastosowano cząstki lentiwirusowe i wprowadzono shRNA swoiste wobec flotiliny-2 do komórek Raw264. Uzyskano kilka klonów komórek ze stabilnie zredukowanym poziomem flotiliny-2, które okazały się także pozbawione flotyliny-1. W komórkach zubożonych we flotyliny odpowiedź na LPS była znacząco osłabiona. Zależny od białka TRIF szlak sygnałowy receptora TLR4 prowadzący do aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3 był zahamowany, a następująca produkcja chemokiny CCL5/RANTES była zmniejszona. Osłabieniu ulegał również szlak sygnałowy zależny od białka MyD88 prowadzący do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NFκB oraz wytwarzania cytokiny TNFα. Ten ostatni efekt był jednak silniej wyrażony w komórkach stymulowanych niskim stężeniem LPS, które wymagają udziału białka CD14. Rzeczywiście, ubytek flotylin: (i) obniżał poziom mRNA CD14; (ii) redukował całkowity poziom CD14; (ii) obniżał ilość CD14 na powierzchni komórek. Nie zaobserwowano takich zmian w odniesieniu do receptora TLR4. Z drugiej strony, wymuszona klasteryzacja CD14 w błonie komórkowej (pierwszy efekt wiązania LPS) indukowała S-palmitoilację flotyliny-1 i flotyliny-2, co wskazuje na wzajemne oddziaływania flotylin i CD14. Nadprodukcja flotilin wraz z 23 członkami rodziny zDHHC ujawniła, że zDHHC5 i zDHHC8 mogą S-palmitoilować flotyliny. Wyciszając Zdhhc5 lub Zdhhc8 stwierdzono, że oba szlaki sygnałowe receptora TLR4 wymagają udziału zDHHC5, z naciskiem na szlak zależny od białka TRIF, co może być związane z udziałem zDHHC5 w S-palmitoilacji flotylin. Podsumowując, uzyskane dane wskazują, że flotyliny modulują komórkowy poziom CD14 i oddziałują (pośrednio) z CD14, wpływając tym samym na intensywność odpowiedzi prozapalnej indukowanej przez LPS. Flotyliny prawdopodobnie biorą udział w endocytozie i recyklingu CD14, a także w transporcie nowo zsyntetyzowanego CD14 do błony komórkowej, przy czym wszystkie te zdarzenia mogą być regulowane przez S-palmitoilację flotylin katalizowaną między innymi przez zDHHC5.Powyższe wyniki uzyskano m.in. dzięki opracowaniu modyfikacji techniki wykrywania palmitoilowanych białek. Polega ona na wzbogaceniu białek znakowanych 17ODYA (analog kwasu palmitynowego) i ich odzyskaniu z kulek sprzęgniętych ze streptawidyną, co umożliwia jednoczesną identyfikację szeregu endogennych i nadprodukowanych palmitoilowanych białek. Technika ta została wykorzystana w badaniach przeprowadzonych we współpracy z Instytutem Genetyki Molekularnej ASCR w Pradze i umożliwiła wykrycie S-palmitoilacji białka adaptorowego leukocytów OPAL1, które może być zlokalizowane w tratwach błonowych.
