Tytuł pozycji:
Molecular determinants of excitability of hindlimb motoneurons after complete spinal cord transection and BDNF overexpression : PhD thesis
Bibliography
Studies using spinal cord injury (SCI) models investigated molecular changes in neurotransmission-related molecules in motoneurons (MNs) mostly at the late postlesion phase, when hyperexcitability considered to be the reason of muscle spasticity is well established. However, in experimental SCI in rodents the onset of spasticity is seen as early as one week postinjury. Patterns and relations of expression level of genes coding for membrane proteins instrumental for excitatory vs inhibitory neurotransmission in the subacute phase of SCI when excitability starts to restore, are not clear.The aim of my work was to clarify the direction and extent of transcriptional regulation of receptors mediating excitatory and inhibitory neurotransmission and of functionally associated channels in hindlimb MNs of adult rats, at the second week postinjury. I hypothesized that fast molecular changes in lumbar MNs develop in response to the loss of inputs. These responses may disturb the balance of excitatory and inhibitory receptors and related ion channels in MNs. Because after SCI the extent of impairment of inputs to MNs innervating extensor and flexor muscles operating at the ankle joint is different, I examined separately MN pools innervating ankle extensor (Gastrocnemius lateralis; GL) and flexor (Tibialis anterior; TA) muscles.A promising way to treat SCI is by spinal cord enrichment with brain derived neurotrophic factor (BDNF). Previous studies showed that BDNF overexpression induced with AAV-BDNF injection caudal to the lesion site improves locomotor abilities and upregulates transcript levels of glutamatergic and GABAergic markers in the interneurons, presynaptic to MNs. While the study showed beneficial role of BDNF in adapting the network to increased activity, undesirable behavioral effects suggesting overexcitability were observed in time, which set my second aim: to characterize the effect of spinal AAV-BDNF administration on gene expression studied in the first part of my project, and identify target molecules of pro-excitogenic potential.Prior to complete spinal cord transection (SCT) at the thoracic Th11 level, retrograde tracers were injected to the respective muscles to identify MNs. After SCT, PBS or AAV-BDNF was injected bilaterally to the lumbar L1/2 segment. Non-lesioned rats with injected tracers served as controls. At two weeks postlesion, locomotor performance of spinal rats was evaluated on a running treadmill. After animal perfusion, GL and TA MNs were isolated from longitudinal spinal sections by laser-assisted microdissection, mRNA was isolated and reverse- transcribed into cDNA. Transcript levels of selected neurotransmitter receptors, ion channels and Cl- transporters were assayed using quantitative PCR.
Streszczenie w języku polskim
Za główną przyczynę rozwoju spastyczności mięśni, powikłania po uszkodzeniach rdzenia kręgowego (SCI), uważa się nadpobudliwość motoneuronów (MN). Zrozumienie podłoża molekularnego spastyczności może pomóc w planowaniu terapii. W badaniach wykorzystujących modele zwierzęce opisano zmiany molekularne w MN związane z neuroprzekaźnictwem. Dostępne dane pochodzą z badań późnej fazy po uszkodzeniu, kiedy nadpobudliwość MN jest ugruntowana. Jednak w doświadczalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego u gryzoni początek spastyczności kończyn można zaobserwować już po tygodniu od urazu. Zmiany ekspresji genów kodujących białka błonowe, które odgrywają rolę w neuroprzekaźnictwie w podostrej fazie, nie są jasne.Celem mojej pracy było wyjaśnienie kierunku i zakresu zmian poziomu transkryptów receptorów pośredniczących w przekaźnictwie pobudzającym i hamującym oraz funkcjonalnie powiązanych kanałów i transporterów błonowych w MN unerwiających mięśnie stawu skokowego dorosłych szczurów. Zmiany badałem w drugim tygodniu po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego (SCT). Postawiłem hipotezę, że w podostrej fazie w MN rozwijają się szybkie odpowiedzi molekularne na skutek osłabienia dopływu bodźców, związanego z utratą części połączeń nerwowych. Odpowiedzi te mogą zaburzać dynamiczną równowagę pomiędzy receptorami pobudzającymi i hamującymi oraz powiązanymi kanałami jonowymi. Ponieważ aferentacja MN unerwiających mięśnie prostowniki i zginacze stawu skokowego jest w różnym stopniu zmieniona po SCT, zbadałem ekspresję genów oddzielnie w grupach MN unerwiających prostownik (Gastrocnemius lateralis, GL; boczna głowa mięśnia brzuchatego łydki) i zginacz (Tibialis Anterior, TA; mięsień piszczelowy przedni) tego stawu.Drugi cel mojej pracy wynikał z obserwacji, że obiecującym sposobem leczenia uszkodzeń i modulowania pobudliwości MN zmienionej po urazie jest wzbogacenie uszkodzonego rdzenia kręgowego w czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF). Poprzednie badania wykazały, że nadekspresja BDNF poprawia zdolności lokomocyjne, czemu towarzyszy zwiększenie poziomu transkryptów markerów glutaminianergicznych i GABAergicznych w sieci interneuronów rdzenia. Choć badanie wykazało korzystną rolę BDNF w zwiększeniu aktywności sieci rdzeniowej, zaobserwowano postępujące w czasie niepożądane efekty behawioralne, sugerujące nadpobudliwość. Dlatego za drugi cel badań obrałem scharakteryzowanie wpływu dordzeniowego podania AAV-BDNF na ekspresję wybranych genów, zbadanych w pierwszej części pracy oraz zidentyfikowanie cząsteczek o potencjale pobudzającym, które ulegają znaczącym zmianom.Przed wykonaniem SCT na poziomie segmentów piersiowych Th11/12, które prowadzi do porażenia tylnych kończyn, wstrzykiwano do mięśni znaczniki fluorescencyjne, umożliwiające identyfikację MN GL i TA. Po SCT podawano do odcinka lędźwiowego L1/2 obustronnie PBS (operowana grupa kontrolna SCT-PBS) lub AAV-BDNF (grupa SCT-BDNF). Szczury ze znacznikami, bez uszkodzeń, służyły jako kontrole. Po 2 tygodniach oceniano sprawność lokomotoryczną zwierząt na ruchomej bieżni. Po sperfundowaniu zwierząt i wypreparowaniu MN GL i TA metodą mikrodysekcji laserowej, izolowano mRNA i przeprowadzano odwrotną transkrypcję do cDNA. Z użyciem ilościowej metody qPCR mierzono poziomy transkryptów wybranych receptorów neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz transporterów jonów chlorkowych
134 pages : illustrations ; 30 cm
Summary in Polish
Bibliografia
134 strony : ilustracje ; 30 cm