New insights into the modulation of the mitochondrial large-conductance calcium-activated potassium channel : interaction with cytochrome c oxidase and carbon monoxide : PhD thesis

Bibliography

Streszczenie w języku polskim

Summmary in Polish

Bibliografia

Podstawowa właściwość mitochondriów – generowanie potencjału w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej – łączy funkcje metaboliczne i sygnalizacyjne tej organelli. Mitochondrialne kanały potasowe o dużym przewodnictwie aktywowane jonami wapnia (mitoBK) dzięki precyzyjnej regulacji ich aktywności umożliwiają kontrolowany napływ jonów K+ do macierzy mitochondrialnej. Dzięki unikatowym mechanizmom regulacyjnym aktywacja kanału mitoBK indukuje mechanizmy cytoprotekcyjne w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Funkcjonalne i strukturalne oddziaływanie kanałów mitoBK z łańcuchem transportu elektronów, a w szczególności z jego terminalnym enzymem oksydazą cytochromu c (COX), może być elementem mechanizmu cytoprotekcyjnego.Do zbadania interakcji między kanałami mitoBK oraz COX wykorzystano różne modele komórkowe z obniżonym poziomem tego enzymu. W ludzkich komórkach gwiaździaka indukowano obniżenie liczby kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA) przez traktowanie 2',3'-dideoksycytydyną. Porównanie kompleksów białkowych tworzonych przez mitoBK i COX w komórkach gwiaździaka z obniżoną iością mtDNA i w komórkach dzikiego typu wskazało na możliwe oddziaływanie podjednostki tworzącej por kanału z kompleksami i respirasomami zawierającymi COX. Ponadto, w przypadku niedoboru COX indukowanego obniżeniem ilości mtDNA wystąpił spadek poziomu podjednostki α kanału mitoBK. Efekt ten był widoczny zarówno na poziomie białka, jak i mRNA. Analiza szlaków sygnałowych indukowanych przez deplecję mtDNA w komórkach gwiaździaka pozbawionych mtDNA wykazała aktywację zintegrowanej sygnalizacji odpowiedzi na stres.Ludzkie fibroblasty skórne z mutacją w podjednostce strukturalnej COX – COX8A – zostały wykorzystane jako kolejny model komórkowy z niedoborem COX. W fibroblastach z niedoborem COX8A i komórkach HEK293T z mutacjami wywołanymi CRISPR/Cas9 w genie kodującym COX8A scharakteryzowano organizację mitochondrialnego łańcucha oddechowego. Uzyskane wyniki wskazały, że kompleks IV w uzyskanych mutantach był obecny w respirasomach. Ponadto, zaobserwowano zmniejszenie ilości białka podjednostki tworzącej pory mitoBK oraz jej kompleksów białkowych.Aby prześledzić ogólnokomórkowe implikacje sprzężenia między łańcuchem oddechowym, w tym COX, a kanałem mitoBK, przeprowadzono doświadczenia elektrofizjologiczne. W badaniach z wykorzystaniem techniki patch-clamp oceniono wpływ gazowego przekaźnika tlenku węgla (CO), przypuszczalnie oddziałującego zarówno z COX, jak i mitoBK. O ilebezpośrednie zastosowanie roztworu nasyconego CO nie spowodowało znaczącej modulacji aktywności kanałów mitoBK, o tyle zastosowanie związków uwalniających CO wywoływało efekty plejotropowe. Zastosowanie hemu i heminy hamowało aktywność kanałów mitoBK. Wykazano, że zastosowanie roztworu nasyconego CO reaktywowało aktywność kanału zahamowanego cząsteczkami hemu

165 pages : illustrations ; 30 cm

The defining property of mitochondria – generation of mitochondrial membrane potential –interlinks the metabolic and signaling functions of this organelle. Mitochondrial large- conductance calcium-activated potassium channels (mitoBK) execute its fine regulation by allowing the controlled influx of potassium ions into the mitochondrial matrix. This functionendows them with unique properties, resulting in a cytoprotective phenomenon of mitoBKactivation in ischemia-reperfusion injury. The functional and structural interaction of mitoBKchannels with the electron transfer chain, and in particular, its terminal enzyme cytochrome c oxidase (COX), can be one of its molecular mechanisms.To investigate the interaction between the COX and mitoBK channels, different COX-deficientcellular models were employed. Specifically, human astrocytoma cells were depleted ofmitochondrial DNA (mtDNA) by the treatment with 2’,3’-dideoxycytidine. The comparison ofthe protein complexes formed by the mitoBK and COX in the mtDNA-depleted and WTastrocytoma cells identified the interaction of the pore-forming mitoBK subunit with the COX-containing complexes and respirasomes. Furthermore, downregulation of mitoBK-α subunits on both protein and mRNA levels occurred upon mtDNA-induced COX deficiency. Theanalysis of the retrograde signaling pathways induced by the mtDNA depletion in the mtDNA-depleted astrocytoma cells showed activation of the integrated stress response signaling.Human dermal fibroblasts with a mutation in the structural COX subunit – COX8A – were usedas another cellular model with a deficiency in COX. The organization of the electron transportchain was characterized in the COX8A-deficient fibroblasts and HEK293T cells with CRISPR/Cas9 induced mutations in COX8A and ensuing COX deficiency, identifying that theresidual COX was stabilized in the respirasomes. The decrease in the protein amount of mitoBKpore-forming subunit, as well as its protein complexes, was observed.To follow the systemic implications of this coupling, the effect of a gaseous transmitter carbonmonoxide (CO), putatively targeting both COX and mitoBK, was assessed in the patch-clampstudies. While direct application of CO-saturated solution has not exerted significantmodulation of the mitoBK channel activity, patch perfusion with CO-releasing moleculesinduced pleiotropic effects. Perfusion with heme and hemin inhibited mitoBK channels. Thesubsequent application of CO-saturated solution released this inhibition, activating mitoBKchannels in the presence of heme

165 stron : ilustracje ; 30 cm