Terapia komórkowa jest gałęzią medycyny regeneracyjnej i dotyczy przeszczepów komórek, w celu odbudowy uszkodzonej tkanki/narządu, kiedy leczenie farmakologiczne i chirurgiczne jest niewystarczające lub nieefektywne. Komórkami stosowanymi w przeszczepach terapeutycznych są zwykle komórki macierzyste, które posiadają potencjał do samoodnowy i wielokierunkowego różnicowania. W tej pracy wybrano udar mózgu jako model uszkodzenia OUN do badań nad wpływem mikrośrodowiska i prekondycjonowania komórek izolowanych z galarety Whartona (WJ-MSC) w fazie przygotowawczej do transplantacji na ich właściwości proregeneracyjne.Endogenne mikrośrodowisko komórek macierzystych zwane „niszą” decyduje o ich przeżyciu i wzroście oraz umożliwia dalsze różnicowanie. Dlatego ważnym elementem tej pracy było zoptymalizowanie biomimetycznego mikrośrodowiska in vitro, które będzie spełniało warunki podobne do endogennych: 1) kontrolnych – hodowla WJ-MSC w warunkach 3D w hydrożelach (z lizatu płytkowego lub fibrynogenu) przypominających składem i właściwościami mechanicznymi tkankę nerwową oraz w warunkach zawartości tlenu (5% O2) typowych dla niszy komórek macierzystych w mózgu; 2) patologicznych – dodatkowa stymulacja w warunkach jw. z czynnikami prozapalnymi.Wykazano, iż zastosowane skafoldy hydrożelowe tworzą strukturę umożliwiającą osadzenie się komórek, ich wysoką przeżywalność oraz migrację poza granice rusztowania. W hodowlach 3D zaobserwowano wzrost ekspresji na poziomie mRNA BDNF, GDNF, VEGF-A, TGF-β1, IL-6, IL-1β w warunkach 21% jak i 5% stężenia tlenu. Dodatkowo, w komórkach hodowanych w 3D zaobserwowano zwiększoną ekspresję markerów neuralnych (nestyny, β-Tubuliny III, NF-200, GFAP) na poziomie mRNA oraz białka. Warunki hodowli 3D wyraźnie zwiększyły odpowiedź komórek na zastosowanie czynników prozapalnych, co skutkowało wzrostem ekspresji na poziomie mRNA czynników troficznych – BDNF, GDNF, VEGF-A i immunomodulacyjnych – TGF-β1, IL-6, IL-1β.W badaniach ex vivo wykorzystano model OGD, polegający na czasowym pozbawieniu tlenu i glukozy, co imituje uszkodzenie ischemiczne. Najsilniejszy efekt zahamowania śmierci neuronów zaobserwowano podczas współhodowli z komórkami z 5% O2 zasiedlającymi skafold fibrynowy. W WJ-MSC zawieszonych w skafoldach i współhodowanych z uszkodzonymi skrawkami hipokampa zaobserwowano wzrost ekspresji GDNF, VEGF-A oraz spadek ekspresji prozapalnej IL-1β, przy jednoczesnym wzroście ekspresji przeciwzapalnego TGF-β1.Badania in vivo przeprowadzono z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu cytotoksycznego uszkodzenia mózgu szczura.Sygnał pochodzący z wyznakowanych nanocząstkami tlenku żelaza WJ-MSC zaobserwowano w miejscu podania (prążkowie) po 24 godz. od transplantacji, a także po 7, 14 i 21 dniach. Po podaniu komórek w 2D oraz 3D zaobserwowano wyraźny sygnał w miejscu lezji podczas obrazowania zależnego od dyfuzji (DWI), którego nie odnotowano w wyniku podania sham, ani w następstwie samego uszkodzenia ogniskowego.W wyniku podania WJ-MSC zaobserwowano zmniejszenie wielkości uszkodzenia mózgu oraz wzrost ekspresji szczurzych markerów: BDNF, GDNF, VEGF-A, TGF-β1. Najwyższy wzrost ekspresji genów stwierdzono w przypadku podania komórek hodowanych w 5% O2, a następnie przeszczepionych w skafoldach. Podanie WJ-MSC skutkowało również spadkiem ekspresji szczurzych IL-6 oraz IL-1β, szczególnie po 24 godz. od transplantacji.Otrzymane wyniki wykazały, że hydrożelowe rusztowania z lizatu płytkowego i fibrynogenu stanowią obiecujący materiał dla potencjalnego wykorzystania w terapii komórkowej chorób OUN. Najbardziej korzystne terapeutycznie jest utrzymywanie komórek w hodowli w warunkach fizjologicznej normoksji (5% O2), a następnie ich przeszczepienie z wykorzystaniem hydrożelowych rusztowań o właściwościach mechanicznych podobnych do tkanki typowej dla mózgu, które jednocześnie będą chroniły komórki przed reakcją układu odpornościowego biorcy.
201 s.: il., wykr., ryc., fotogr.; 30 cm
Bibliografia od str. 187-201
Cell therapy is a branch of regenerative medicine and relates to cell transplantations in order to rebuild damaged tissue/organ when pharmacological and surgical treatment is insufficient or ineffective. Stem cells characterized by potential to self-renew and multilineage differentiation are most commonly used for transplantations in regenerative medicine. Ischemic stroke was selected as a model of CNS damage to analyze the influence of the microenvironment and preconditioning in the pre-transplantation phase on the stem cells isolated from Wharton’s Jelly (WJ-MSCs) pro-regenerative properties.The endogenous stem cells microenvironment, known as the “niche”, determines their survival and growth, and enables further differentiation. Therefore, an important element of this work was to optimize the biomimetic microenvironment in vitro, which mimics the conditions similar to the endogenous: 1) control – WJ-MSCs cultured in 3D conditions in a hydrogels (made from platelet lysate or fibrinogen) resembling the composition and mechanical properties of nervous tissue and under 5% oxygen concentration, typical of the stem cell niche in the brain; 2) pathological – additional stimulation under the conditions as above with the pro-inflammatory factors.It was shown that the 3D hydrogel scaffolds create a structure that allows the cells deposition, their high survival, and migration beyond the scaffolds. Moreover, an increased expression of BDNF, GDNF, VEGF-A, TGF-β1, IL-6, IL-1β were observed under both 21% and 5% O2. Additionally, in WJ-MSCs cultured in 3D scaffolds, an increased expression of neural markers (nestin, β-Tubulin III, NF-200, GFAP) was observed at the mRNA and protein levels. The 3D culture conditions significantly increased the response of WJ-MSCs to the pro-inflammatory factors – a significantly increased mRNA expression of trophic factors – BDNF, GDNF, VEGF-A, and immunomodulatory factors – TGF-β1, IL-6, IL-1β was observed.In ex vivo studies, the OGD model (temporary oxygen and glucose deprivation) was used, which imitates an ischemic injury. The strongest effect was observed after the co-culture with WJ-MSCs preincubated in 5% O2 and fibrin scaffolds. An increased expression of GDNF, VEGF-A and a decreased expression of pro-inflammatory IL-1β with a simultaneous increase in the expression of the anti-inflammatory TGF-β1 was observed in WJ-MSCs encapsulated in scaffolds and co-cultured with damaged organotypic hippocampal slices.In vivo studies were conducted using an experimental model of rat brain injury. The signal from WJ-MSCs labelled with iron oxide nanoparticles was observed in the injection site (striatum) 24 hours after transplantation, and also 7-, 14-, and 21- days post-transplantation. In addition, after the WJ-MSCs transplantation in 2D or 3D, a signal was detected at the lesionsite during diffusion-weighted imaging (DWI), which was not observed in sham groups or after only the focal injury.After the WJ-MSCs transplantation, a decreased size of the brain-damaged area and an increased expression of rat markers: BDNF, GDNF, VEGF-A, TGF-β1 were detected. The highest increase in the genes’ expression level was observed after transplantation of the cells that were cultured in physiological normoxia conditions (5% O2) and then transplanted in scaffolds. Transplantation of WJ-MSCs caused also the decreased expression of rat IL-6 and IL-1β, especially after 24 hours.The obtained results showed that the hydrogel scaffolds made of platelet lysate and fibrinogen used in this study are promising material for potential use in cell therapy of central nervous system disorders. The most preferred therapeutic approach is the maintaining of the cells in culture under physiological normoxia (5% O2) followed by their transplantation as encapsulated in hydrogel scaffolds. These scaffolds should maintain mechanical properties similar to those found in the brain.
