Struktura i zmienność genów MHC klasy I u nornicy rudej.

Klasyczne geny MHC charakteryzują się największą zmiennością ze wszystkich genów kręgowców. Jedną z klas genów MHC są MHC I, które kodują białka transbłonowe zaangażowane w prezentowanie antygenów pochodzenia wewnątrzkomórkowego. Celem tej pracy było scharakteryzowanie struktury i zmienności tych genów u nornicy rudej, co jest warunkiem koniecznym do prowadzenia badań nad adaptacyjnym znaczeniem genów MHC I u tego gatunku, zarówno w odporności na patogeny, jak i wyborze partnera do rozrodu. Badania przeprowadziłem na próbie 12 osobników, wykorzystując klasyczną metodę klonowania i sekwencjonowania Sangera. Otrzymałem 28 różnych alleli, dla których średnia dywergencja wyniosła 18,8%. Dystans genetyczny był większy w obrębie 2. i 3. eksonu (20,6%), czyli w sekwencjach kodujących rowek wiążący antygeny. Wykryłem, że dwa z opisanych alleli pochodziły z nieklasycznego genu MHC I. Pozostałe allele pochodziły prawdopodobnie z klasycznych genów, których liczba różniła się pomiędzy osobnikami (3-4). Niestety nie udało się na podstawie podobieństwa sekwencji ani współwystępowania alleli w osobnikach przypisać ich do poszczególnych loci. W obrębie tych sekwencji odnalazłem 13 miejsc znajdujących się pod doborem pozytywnym, które były nadreprezentowane w miejscach ludzkich ABS. Otrzymane wyniki wykorzystałem do skonstruowania drzewa filogenetycznego oraz wnioskowania o ewolucji genów MHC I u gryzoni. Obraz ten jest inny niż w przypadku rzędu naczelnych i sugeruje istnienie bardziej dynamicznych procesów prowadzących do utraty ortologii klasycznych genów MHC I. Ostatecznie zaprojektowałem dwie pary specyficznych dla gatunku starterów, namnażających drugi i trzeci ekson. Zastosowana przeze mnie metoda klonowania i sekwencjonowania Sangera jest klasycznym podejściem do rozwiązywania problemu otrzymywania danych dla rodzin genów. Ma ona jednak wiele wad, takich jak liczne artefakty, duża pracochłonność czy kosztochłonność. Alternatywnym podejściem, niwelującym wiele problemów, może być w przyszłości wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji.

Classical MHC genes are known as the most variable genes in all vertebrates. MHC class I genes encode transmebrane proteins, involved in binding and presenting endogenous antigens to lymphocytes T. The main aim of the present study was to characterize the structure and variability of MHC class I genes in the bank vole. Such characterization is essential for future studies of addressing the adaptive significance of these genes in the bank vole, both in fighting pathogen assault and in mate choice. I extracted RNA from 12 individuals and reverse transcribed it to cDNA. Exons 1 to 4 were PCR-amplified, amplicons were cloned and multiple clones from each amplicon were Sanger-sequenced. I identified 28 alleles. Overall mean divergence was 18,8%, and the divergence was higher in exons 2-3 (20,6%). Exons 2-3 encode domains building peptide binding region. Two of alleles were apparently derived from a nonclassical gene. The remaining alleles represented probably classical genes, and numbers of these genes varied between individuals (3-4). Assignment of alleles to loci was not possible. In the sequences of the classical class I alleles I found 13 sites under positive selection; these sites were over-represented in amino-acid positions identified in human proteins as Antigen Binding Sites. The phylogenetic tree was constructed, using the bank vole sequences and representative sequences from other rodents, to better understand evolution of MHC I genes in Rodentia. The phylogenetic analysis showed the lack of orthology of classical genes between species, sequences clustered according to species. The likely causes of this lack of orthology have been dynamic processes of gene duplication, deletion, conversion and interlocus recombination. Nonclassical class I genes appear more conserved, and we can identify ortologs between species in some cases. Finally I proposed two pairs of primers to amplify exon 2 and exon 3 MHC Ia genes in bank vole.I used cloning/Sanger sequencing which is classical approach for resolving multigene family problem. However it has some disadvantages, being costly, time-consuming and artifacts-prone. I discuss an alternative approach, employing new generation sequencing.