Badanie wpływu przeciwciał monoklonalnych wiążących gangliozyd GD2 na adhezję komórek ludzkiej linii neuroblastoma do białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz na fosforylację białek

Neuroblastoma is the most frequent extracranial solid tumour in childhood, which originate from sympathetic nervous system precursors of neural crest. Despite of intensive chemotherapy, prognosis for patients in advanced stage is still poor, so there is necessity to looking for new therapeutic strategies such as immunotherapy. One of the antigens highly expressed on NB cells, with limited expression on normal tissues, is GD2 ganglioside. This feature makes it good target for immunotherapy. It seems that antibodies which bind this antigen can kill tumour cells not only through effector mechanism, but also directly.In this study two anti-GD2 antibodies: 14G2a and ME361-S2a, were tested for their ability to impair attachment of human neuroblastoma cell line IMR-32 to extracellular matrix proteins. It was shown that they are capable of inhibiting adhesion of these cells to fibronectin, laminin and collagen IV by about 50%, as well as changing their morphology and decreasing viability. Another aim of the study was to determine the role of 14G2a in intracellular signaling pathways. Protein arrays were used to detect phosphorylated forms of proteins, especially kinases. My studies have shown that binding of anti-GD2 antibody causes hypo- or hyperphosphorylation of proteins and as a result alters their function. These changes give rise to inhibition of promitotic mTOR pathaway components like Akt, mTOR, p70S6 or p27, due to their dephosphorylation and consequently loss of their activity. On the other hand, the antibodies tested increased the phosphorylation level of mTOR inhibitor protein - AMPK. Together, these results contribute to our knowledge about the cytotoxity mechanism of anti-GD2 antibodies on human neuroblastoma cells. They create perspectives for further research to better understand their influence on another pathways which cause death of these cells.

Neuroblastoma (NB) to najczęstszy pozaczaszkowy lity nowotwór wczesnodziecięcy, wywodzący się z wchodzących w skład układu współczulnego prekursorowych komórek cewy nerwowej. Pomimo intensywnej chemioterapii rokowania dla dzieci w zaawansowanym stadium choroby pozostają niezadowalające, stąd też konieczność szukania innych strategii, takich jak m.in. immunoterapia. Jednym z antygenów ulegających wysokiej ekspresji na komórkach NB, a jednocześnie silnie ograniczonej na komórkach zdrowych, jest gangliozyd GD2. Stanowi on zatem dobry cel dla immunoterapii. Okazuje się, że przeciwciała wiążące się do tego antygenu mogą zabijać komórki nowotworowe nie tylko na drodze efektorowej, ale także bezpośredniej.W niniejszej pracy badano wpływ przeciwciał monoklonalnych 14G2a i ME361-S2a rozpoznających GD2, na adhezję komórek ludzkiej linii neuroblastoma IMR-32 do białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Pokazano, że hamują one przyczepność tych komórek do fibronektyny, lamininy i kolagenu IV o ok. 50%, powodując jednocześnie zmiany ich morfologii i obniżając żywotność. Ponadto określono wpływ 14G2a na wewnątrzkomórkowy przekaz sygnału, wykorzystując macierze białkowe wykrywające fosforylowane formy wybranych białek, w tym głównie kinaz. Okazuje się, że w wyniku związania przeciwciał anty-GD2 część białek ulega hipo-, a część hiperfosforylacji, przekładającej się na ich funkcjonalność. Zmiany spowodowane dodanymi przeciwciałami doprowadziły m.in. do zahamowania promitotycznego szlaku związanego z mTOR, poprzez zmiany stopnia ufosforylowania białek Akt, mTOR, p70S6 oraz p27, skutkujących spadkiem ich aktywności. Zaobserwowano jednocześnie wzrost fosforylacji kluczowej reszty aminokwasowej kinazy AMPK, hamującej mTOR.Uzyskane wyniki przyczyniły się do pogłębiania wiedzy na temat mechanizmu bezpośredniej cytotoksyczności przeciwciał rozpoznających GD2, w stosunku do ludzkich komórek neuroblastoma. Otwierają one jednocześnie drogę do dalszych prac, mających na celu szczegółowe określenie ich wpływu na inne szlaki przekazu sygnału skutkującego śmiercią tych komórek.