Characterisation of murine neuroblastoma model developed with BE(2)-C cell line in nude mice.

Neuroblastoma (NB) to embrionalny guz pozazwojowy współczulnego układu nerwowego, o niezwykle zróżnicowanym przebiegu klinicznym i biologii. Nerwiak zarodkowy współczulny jest najpowszechniejszym pozaczaszkowym litym guzem u dzieci i stanowi około 10 % złośliwych guzów wieku niemowlęcego i dziecięcego. Istnieje wiele zwierzęcych modeli tej choroby, które mimo różnic w zastosowaniu i tworzeniu mają jedną wspólną cechę, a mianowicie służą poznaniu i zwalczaniu neuroblastoma.Celem mojej pracy magisterskiej było scharakteryzowanie i wprowadzenie do badań w Pracowni Genetyki Molekularnej i Wirusologii nowego modelu in vivo w oparciu o ludzką linię neuroblastoma BE(2)-C i myszy nude. W ramach poznania modelu wykonano standaryzację kilku metod umożliwiających czułą i specyficzną detekcję komórek neuroblastoma.Metodami detekcji wykorzystywanymi w niniejszej pracy były: hodowle komórkowe, cytometria przepływowa, barwienie immunoenzymatyczne hodowli komórek wyizolowanych ze szpiku i krwi obwodowej zwierząt oraz RT-nPCR (ang. reverse transcription – nested polymerase chain reaction), RT-PCR (ang. reverse transcription – polymerase chain reaction) i Western blot na próbkach pozyskanych ze szpiku zwierząt eksperymentalnych. Optymalizacja wymienionych metod pozwoliła ustalić próg detekcji i optymalne warunki eksperymentu dla każdej z technik, wykorzystując cztery markery neuroblastoma, którymi są: gangliozyd GD2, transkrypt i białko genu hydroksylazy tyrozyny oraz transkrypt genu PHOX2B.Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że wprowadzany model wzrostu in vivo ludzkiej linii neuroblastoma BE(2)-C, wykorzystujący myszy nude działa prawidłowo. W ramach scharakteryzowania opracowywanego modelu ustalono, że metodą detekcji, która ma najwyższą czułością jest RT-nPCR, z wykorzystaniem transkryptu hydroksylazy tyrozyny jako markera neuroblastoma. Aby wzbogacić model o kolejną metodę detekcji, proponuje się przeprowadzenie dodatkowej optymalizacji dla metody RT-nPCR, wykorzystującej transkrypt PHOX2B jako marker nowotworowy. Jej wysoka czułość i specyficzność zapewni o poprawności detekcji neuroblastoma w próbkach szpiku wyizolowanych od zwierząt doświadczalnych.

Neuroblastoma (NB) is an embrional malignancy of the postganglionic sympathetic nervous system, exhibiting considerable clinical and biological heterogeneity. It is the most common extracranial solid tumour in children, representing approximately 10% cancers in infancy and childhood. A wide range of animal models has been developed for neuroblastoma. Being created with different methods and for different purposes, all these models share a common goal, that is to gain the knowledge sufficient to combat neuroblastoma.The aim of my research was to characterise and introduce in the Laboratory of Molecular Genetics and Virology a new in vivo neuroblastoma animal model, using BE(2)-C cell line and nude mice. This involved standardisation of several methods for sensitive and specific detection of neuroblastoma cells in animal tissue samples.During my research I used the following methods to detect cancer cells in bone marrow and peripheral blood samples isolated from animals: cell cultures, flow cytometry and immunoenzymatic staining. In addition RT-nPCR (reverse transcription – nested polymerase chain reaction), RT-PCR (reverse transcription – polymerase chain reaction) and Western blot were used to detect the presence of neuroblastoma in bone marrow samples. Optimisation of these methods allowed me to establish a detection threshold and suitable conditions for each technique, using four neuroblastoma markers such as GD2 ganglioside, the transcript and the protein of the tyrosine hydroxylase gene and the transcript of the gene PHOX2B.Based on the results of my research, it can be concluded that the newly introduced in vivo neuroblastoma animal model is working properly. In a series of the experiments RT nPCR to detect the tyrosine hydroxylase gen expression, the neuroblastoma marker enabled the most sensitive detection of the tumour cells. To enrich the model with yet another method of detection, it is proposed to carry out an additional optimization for the RT-nPCR method, using the PHOX2B transcript as a tumour marker. High sensitivity and specificity of this method would ensure a correct detection of the presence of metastates in the bone marrow samples from the tumour – bearing animals.