Badanie wyciszenia ADAM17 i ADAM10 oraz wpływu tych sekretaz na uwalnianie TNFα i NO w komórkach linii P388D1. Badanie wpływu wyciszenia sekretazy ADAM17 na wewnątrzkomórkowy przekaz sygnału.

ADAM17 and ADAM10 are members of the ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) family. They are able to shed numerous cytokines, growth factors and their receptors from cell membrane and because of that they have great involvement in the regulation of immune system functioning, processes of cell growth and differentiation. The aim of this study was to obtain stably silenced-ADAM17 and ADAM10 clones of P388D1 cells via transfection of the cells with suitable shRNA-codnig plasmid and subsequent selection with hygromycin and geneticin. Silencing of target genes expression was checked with Real time Quantitative PCR and Northern Blotting methodes. On the basis of these results, clones characterized by the lowest level of ADAM17 and ADAM10 were chosen to further in vitro experiments.The second part of the work focused on ADAM17 and ADAM10 functions. The outcome of the analysis confirmed the role of ADAM17 in PMA-induced shedding of TNFalpha. Furthermore, results demonstrate that silencing of ADAM17 resulted in a significant inhibition of NO production. In these experiments ADAM10 does not take part in TNFalpha shedding and NO secretion and it is ADAM17, which plays a major role in these processes.Finally, the attempt was made to answer the question if silencing of ADAM17 secretase has the influence on intracellular signal transduction. It was shown that signalling pathways leading to activation of AP-1 transcription factor can be involved in regulation of transcription of immune response and inflammatory genes e.g. iNOS, IL-6. It was confirmed that there is no correlation between the level of ADAM17 expression and activation of NFkappaB and STAT1.

ADAM17 i ADAM10 należą do rodziny metaloproteaz dysintegrynowych. Uczestniczą one w ścinaniu licznych cytokin, czynników wzrostu i ich receptorów z błony komórkowej i z tego powodu wywierają ogromny wpływ na regulację funkcjonowania układu immunologicznego, procesów wzrostu i różnicowania komórek.Celem niniejszej pracy było uzyskanie klonów linii P388D1 z obniżoną ekspresją ADAM17 i ADAM10 poprzez transfekcję komórek plazmidem z odpowiednim shRNA i selekcję klonów przy użyciu higromycyny i genetycyny. Wyciszenie ekspresji docelowych genów zostało sprawdzone techniką PCR w czasie rzeczywistym i potwierdzone metodą Northern Blotting. Na podstawie tych wyników, do dalszych eksperymentów in vitro wybrano klony charakteryzujące się najniższym poziomem ekspresji ADAM17 i ADAM10.W drugiej części pracy skupiono się na zbadaniu funkcji ADAM17 i ADAM10. Wyniki przeprowadzonych analiz potwierdziły rolę ADAM17 w stymulowanym przez PMA ścinaniu TNFalpha. Ponadto, wyniki pokazują, ze wyciszenie ekspresji ADAM17 prowadzi do znacznego zahamowania produkcji NO. Przeprowadzone doświadczenia wskazują, że ADAM10 nie bierze udziału w ścinaniu TNFalpha i wydzielaniu NO, a główną rolę w tych procesach odgrywa ADAM17.Ostatecznie podjęto się próby odpowiedzi na pytanie czy wyciszenie sekretazy ADAM17 wpływa na wewnątrzkomórkowy przekaz sygnału. Pokazano, że ścieżki sygnalizacyjne prowadzące do aktywacji czynnika transkrypcyjnego AP-1 mogą być zaangażowane w regulację transkrypcji genów związanych z układem immunologicznym i stanem zapalnym w tym iNOS, IL-6. Wykazano, że aktywacja czynników transkrypcyjnych STAT1 i NFkappaB jest niezależna od stopnia wyciszenia ADAM17.