The use of capillary electrophoresis (CE) for the quantitative analysis of drugs has become increasingly popular. The separation mechanism in capillary electrophoresis is the same as that in the conventional electrophoresis and it is based on the simultaneous action of electromigration (electrophoretic flow) and electroosmotic flow (EOF), which makes it ideal for small molecules such as pharmaceuticals.In the present paper capillary electrophoresis in the frontal analysis mode was used to determine the extent of binding of dexamethasone to human (HSA) and bovine serum albumin (BSA). The principle of this assay is to determination the concentration of the free drug based on the ratio of the height of the plateau peak obtained during electrophoresis of drug-protein mixture to the one obtained during electrophoresis of the samples containing only drug, without protein.The first step of this study was to optimize the conditions for separation of drug from protein in their mixture by taking into account factors such as: the buffer pH and composition, applied voltage, injection time and the wavelength at which the concentration of free drug was measured.Then, in accordance to the guidelines of Good Laboratory Practice (GLP) present method was validated in order to obtain parameters such as linearity, precision, accuracy, repeatability, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ).The next step was to investigate the process of binding of DXM to BSA and HSA, the concentration of DXM was measured at two wavelengths: 214 nm (data from literature) and 237 nm (maximum of absorbance). One class of binding site and nonspecific binding were obtained from non-linear curve fitting and parameters describing the binding process, such as binding constant, the number of binding sites, binding capacity and percent of binding were determined. For assay of free DXM made at a wavelength of 214 nm for binding process with BSA the following values were obtained: the binding constant Ka equals 3,98·105 M-1, the number of binding sites n was 0,36 and binding capacity nKa was 14,49·102. In the case of binding DXM to HSA the binding constant Ka the number of binding sites n and the binding capacity nKa were 9,15·104 M-1, 1,62 and 14,78·104 respectively. Similarly analysis of the concentration of free DXM carried out at a 237 nm wavelength allowed to obtain the following values for the binding of DXM to BSA: the binding constant Ka was 4,36·104 M-1, the number of binding sites n was 0,48, binding capacity nKa was118 | S t r o n a21,06·103. In the case of binding DXM to HSA the binding constant Ka, number of binding sites n and binding capacity nKa were 3,40·104 M-1, 1,85 and 62,83·103 respectively.At the same time a classical Scatchard analysis was performed and the results indicated a possibility of existence of a model with two classes of binding sites for binding study of DXM to both BSA and HSA at both wavelengths.In conclusion it can be assumed that the method of CE/FA complies with the conditions of GLP and it is useful to determine and evaluate the binding parameters of investigated drug to albumins. Based on the data obtained and according to data from literature DXM can be classified as a drug with average strength of binding to BSA and to HSA. It should be noted that origin of protein used in the analysis affects binding parameters. The results of the binding parameters obtained in the study also dependent on the wavelength at which measurements of concentrations of free drug were taken.
Zastosowanie elektroforezy kapilarnej (CE) do analizy ilościowej leków staje się coraz bardziej popularne. Mechanizm separacji w elektroforezie kapilarnej jest taki sam jak w konwencjonalnej elektroforezie i opiera się na jednoczesnym działaniu elektromigracji (elektroforetycznego przepływu) i przepływu elektoosmotycznego (EOF), przez co idealnie nadaje się do małych cząsteczek, takich jak farmaceutyki.W niniejszej pracy zastosowano elektroforezę kapilarną w odmianie frontalnej (CE/FA) do określenia wiązania się deksametazonu (DXM) z albuminą ludzką (HSA) i bydlęcą (BSA). Zasada oznaczenia oparta jest na wyznaczeniu stężenia wolnego leku na podstawie stosunku wysokości piku DXM w mieszaninie leku z białkiem do wysokości piku próbki kalibracyjnej otrzymanej po nastrzyknięciu roztworu leku bez białka.Pierwszym etapem badań była optymalizacjia warunków rozdziału leku od białka w ich mieszaninie, biorąc pod uwagę takie czynniki jak: skład i pH buforu, przyłożone napięcie, czas nastrzyku oraz długość fali, przy której mierzono stężenie wolnego leku.Następnie, zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (GLP) walidowano opracowaną metodę, celem wyznaczenia takich parametrów jak: liniowość, precyzja, dokładność, powtarzalność, limit detekcji (LOD) i granica oznaczalności (LOQ).Kolejnym etapem pracy było zbadanie procesu wiązania DXM z BSA i HSA, stężenia wolnego DXM mierzono przy dwóch długościach fali: 214nm (dane z piśmiennictwa) i 237nm (maximum absorbancji). Wykorzystując analizę regresji nieliniowej, uzyskano model wiązania o jednej klasie miejsc wiążących i wiązanie niespecyficzne oraz wyznaczono parametry opisujące proces wiązania, takie jak: stałą wiązania, liczbę miejsc wiążących, pojemność wiązania i procent wiązania. Dla pomiarów wolnego DXM dokonywanych przy długości fali 214 nm otrzymano następujące wartości dla wiązania badanego leku z BSA: stałą wiązania Ka równą 3,98·105 M-1, liczbę miejsc wiążących n i pojemność wiązania nKa wynoszące odpowiednio 0,36 i 14,49·102, natomiast w przypadku wiązania DXM z HSA: stała wiązania Ka była równa 9,15·104 M-1, liczba miejsc wiążących n wynosiła 1,62 a pojemność wiązania nKa 14,78·104. Podobnie analiza prowadzona dla stężeń oznaczonych przy długości fali równej 237 nm, wykazała następujące wartości parametrów wiązania DXM z BSA: stałą wiązania Ka równą 4,36·104 M-1, liczbę miejsc wiążących n o wartości 0,48, pojemność wiązania nKa wynoszącą 21,06·103 natomiast w przypadku wiązania z HSA stała wiązania Ka, liczba miejsc wiążących n oraz pojemność wiązania wynosiły odpowiednio 3,40·104 M-1, 1,85, 62,83·103.116 | S t r o n aPrzeprowadzono także klasyczną analizę Scatcharda, która wskazywała na możliwość istnienia modelu o dwóch klasach miejsc wiążących w procesie wiązania badanego leku z BSA i HSA.Podsumowując, można stwierdzić iż metoda CE/FA spełnia warunki GLP i jest przydatna do wyznaczenia oraz oceny parametrów wiązania DXM z badanymi albuminami. Na podstawie otrzymanych danych, zgodnie z danymi z piśmiennictwa można sklasyfikować DXM jako lek o średniej sile wiązania zarówno z BSA, jak i HSA. Należy zwrócić uwagę, że rodzaj białka użytego w analizie wpływa na parametry wiązania, co świadczy o występowaniu gatunkowych różnic w procesie wiązania badanego leku z albuminą. Uzyskane wartości parametrów wiązania zależą także od długości fali, przy której dokonywano pomiaru stężenia wolnego leku.
