Heterologous expression of a recombinant chitinase VfCh1 and its characterization in terms of potential applications

Extracellular chitinase produced by carnivorous plant Dionaea muscipula during the digestion of the pray is a newly identified enzyme. In this study the protein overexpression in heterologous system and its characterization was performed.In the introduction one can find general information about chitinases, including the classification of those enzymes, potential substrates as well as proposed mechanism of catalysis, regulation of enzymatic activity and the role of the chitinases in plants. Separate sections describe the phenomena of carnivorous plants, focusing on the enzymes participating in the digestion process and their potential use in the lab and industry scale.The experimental part of the study was dedicated to obtain a recombinant chitinase (VfCH1) in a heterologous expression system, its purification and characterization. The sequence encoding chitinase was cloned and integrated to the pPICZαC plasmid. Then a strain of Pichia pastoris KM71H was transformed using such construct in order to obtain expression of the protein of interest. After a mass spectrometry analysis, the production of chitinase with some modification pattern was confirmed. The enzyme was purified from the extracellular medium using an affinity chromatography. Enzymatic activity tests indicated specificity for synthetic derivatives of N-acetylglucosoamine as well as for the α-type chitin. Based on bioinformatics analysis, the enzyme was classified as a class I, family 19, glycoside hydrolase and endochitinase. The recombinant chitinase exhibits maximal activity in 50°C, pH=5,0. The enzyme is stable over wide range of pH and temperature. Its activity is also not affected by high salt concentration. Divalent cations are not necessary for the activity. That surprising stability combined with very high storage stability makes the chitinase from Dionaea muscipula very attractive for the potential application in broad range industry.

Zewnątrzkomórkowa chitynaza, wchodząca w skład płynu trawiennego wytwarzanego przez mięsożerną roślinę z gatunku Dionaea muscipula jest jednym z nowo zidentyfikowanych enzymów. Niniejsza praca poświęcona jest uzyskaniu nadekspresji tego białka w układzie heterologicznym oraz jego charakterystyce.Wprowadzenie przybliża zebrane do tej pory informacje dotyczące chitynaz. Przedstawiono klasyfikację tych enzymów, wykorzystywane przez nie substraty, a także proponowany mechanizm katalityczny i regulację ich aktywności enzymatycznej. Osobny paragraf poświęcono na omówienie roli chitynaz, ze szczególnym uwzględnieniem chitynaz roślinnych. Zwrócono również uwagę na to jak szczególnym układem badawczym są rośliny mięsożerne oraz omówiono obecne i potencjalne zastosowania chitynaz w skali laboratoryjnej i przemysłowej.Część doświadczalna została poświęcona otrzymaniu rekombinowanej chitynazy (VfCh1) w heterologicznym systemie ekspresyjnym, jego oczyszczeniu oraz charakterystyce właściwości enzymatycznych. Sekwencja kodująca chitynazę została sklonowana, umieszczona w wektorze pPICZαC i przeniesiona do szczepu Pichia pastoris KM71H w celu jej ekspresji. Uzyskane wyniki potwierdziły zewnątrzkomórkową produkcję białka o masie około 35 kDa, którego tożsamość potwierdzono za pomocą spektrometrii mas. Otrzymaną chitynazę oczyszczono z nadsączu hodowlanego przy użyciu chromatografii powinowactwa. Uzyskane wyniki wskazały również na modyfikację powodującą wzrost masy cząsteczkowej enzymu. Testy aktywności enzymatycznej wykazały specyficzność w kierunku syntetycznych pochodnych N-acetyloglukozaminy, jak również w kierunku krystalicznej chityny typu α. Badany enzym zaklasyfikowano do endochitynaz, a na podstawie analizy bioinformatycznej przypisano go do chitynaz klasy I, rodziny 19 hydrolaz glikozydowych. Rekombinowana chitynaza wykazuje maksymalną aktywność w temperaturze 50°C i w pH 5,0. Enzym cechuje się wysoką stabilnością w szerokim zakresie temperatur i pH oraz trwałością termiczną w trakcie przechowywania Dwuwartościowe kationy nie są niezbędne do jego działania, a wysokie stężenia soli nie obniżają jego aktywności. Właściwości te są cenne dla potencjalnego zastosowania rekombinowanej chitynazy w przemyśle.