Klonowanie, ekspresja i oczyszczanie białka PG0023 z systemu sekrecji Porphyromonas gingivalis W83

Porphyromonas gingivalis jest głównym patogenem odpowiedzialnym za rozwój paradontozy, choroby dotykającej około 30% dorosłej populacji ludzkiej w krajach wysoko rozwiniętych. Bakteria rozwija się głównie w kieszonkach przyzębnych dzięki wydzielaniu do najbliższego otoczenia dużej liczby czynników wirulencji, w tym dobrze już poznanych enzymów proteolitycznych. Wydzielanie czynników wirulencji P. gingivalis na zewnątrz komórki zachodzi poprzez nowy, wcześniej nieznany system sekrecji. Dotychczasowe badania ukazały, że w jego skład wchodzi co najmniej siedem białek błonowych i periplazmatycznych przy czym w literaturze opisano do tej pory jedynie cztery z nich - Sov, PorT, PG0023, PG0534. W prezentowanej pracy sklonowano gen pg0023 do wektora ekspresyjnego pETDuet-1 w celu otrzymania konstruktu z metką histydynową na N-końcu białka. Wykonano optymalizację warunków ekspresji białka z użyciem dwóch szczepów ekspresyjnych E. coli. Znaczna ekspresja białka do ciałek inkluzyjnych wymusiła zastosowanie warunków denaturującyh w celu otrzymania białka w formie rozpuszczalnej. Wstępny etap oczyszczania obejmował płukanie otrzymanych podczas ekspresji ciałek inkluzyjnych. Tak przygotowane białko poddawano refoldingowi oraz oczyszczaniu metodą chromatografii powinowactwa. Zwinięte białko PG0023 otrzymane metodą refoldingu przez dializy poddano sączeniu molekularnemu w celu sprawdzenia czy tworzy ono struktury IV-rzędowe. Uzyskany wynik świadczy prawdopodobnie o dimeryzacji białka. W celu sprawdzenia czy otrzymane białko uzyskało poprawną konformację, przeprowadzono analizę zależnej od temperatury ruchliwości elektroforetycznej w żelu poliakrylamidowym. Otrzymane rezultaty ukazały brak cech charakterystycznych dla białka o strukturze β-beczki. Wyniki degradacji otrzymanego białka przez wybrane proteazy występujące w jego otoczeniu ukazały, że białko pozbawione błonowego otoczenia jest nieodporne na proteolizę.

Porphyromonas gingivalis is a major pathogen in destructive periodontal diseases in humans, which affects about 30% of human adult population worldwide. The bacterium grows mainly in periodontal pockets through secretion of a large number of virulence factors, including the well-known proteolytic enzymes, gingipains. Secretion of virulence factors outside the cell of P. gingivalis occurs through a new, previously unknown secretion system. Previous studies have shown that it comprises at least seven membrane and periplasmic proteins, but only four of them have been described in the literature so far - SOV, Port, PG0023, PG0534.The present study presents a process of cloning pg0023 gene to an expression vector pETDuet-1 in order to achieve a construct with HisTag at the N-terminal of the protein. To optimize the conditions of the protein expression two bacterial strains of E. coli were used. The high level of expression of the protein to inclusion bodies imposed the usage of denaturating conditions to convert a protein into a soluble form. Initial purification phase included rinsing inclusion bodies. Afterwards, prepared protein was refolded and purified by affinity chromatography. Folded protein PG0023 obtained by the dialysis refolding-method. It was then analyzed by the size exclusion chromatography in order to determine if it has adopted a quaternary structure. Obtained result proves that protein probably dimerize. In order to check if protein has correct conformation, the temperature-dependent-mobility in SDS PAGE test was performed. The results revealed no features typical for β-barrel protein in analyzed samples. Outcomes acquired by protein degradation by selected proteases present in protein’s environment proved that the protein devoided its natural membrane environment is sensitive to proteolysis.